虾肝肠胞虫4个孢壁蛋白基因的鉴定、序列特征及表达分析

李枝敏，王 元，房文红，周俊芳，李新苍

（1.农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室，中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，国家水生动物病原库，上海 201306）

虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，简称EHP），属微孢子虫目（Microsporidia），微孢子虫科（Nosematidae），肠胞虫属，是一种主要寄生在对虾肝胰腺细胞中的单细胞真核生物。EHP最早于2004 年在泰国斑节对虾（Penaeus monodon）肝胰腺细胞内被检测到［1］，直到2009年TOURTIP等［2］才将其正式命名为虾肝肠孢虫，并将其认定为肠上皮细胞微孢子虫属的一个新种。随后，国内外均对EHP开展了大量的研究，研究内容涉及EHP检测方法、流行病学、典型临床症状和病理变化等［3-13］，如目前已建立对虾EHP的LAMP检测方法［3-4］和TaqMan荧光定量PCR检测方法［5-6］，均可用于病原的快速检测；流行病学研究显示，EHP主要通过水平方式进行传播，但也有研究人员发现该病原也可以通过垂直方式传播［7-11］；前期大量研究表明，EHP感染对虾的典型临床症状为生长缓慢或停滞，有时出现白便症状，但对虾的存活率没有显著改变［9，11］。综合已有文献发现，目前对EHP的生物学特性还缺乏足够了解，关于该病原的一些重要科学问题，如在国内暴发流行的EHP与国外流行株是否属于同一个种，该病原在世界流行暴发是否会导致某些基因产生变异等，尚无明确报道。此外，EHP侵染的分子机制仍不清楚。因此有必要鉴定一批可能与EHP侵染相关的分子，开展前期基础研究，为EHP侵染机制乃至疾病防控提供基础数据。

孢壁蛋白位于微孢子虫孢子的最外层，研究表明某些孢壁蛋白能与宿主细胞表面组分直接接触，参与侵染过程。例如，家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）的特定孢壁蛋白在其侵染宿主的过程中发挥了重要的作用［14-15］，提示EHP的某些孢壁蛋白也可能参与了宿主的侵染过程。因此，鉴定EHP孢壁蛋白种类，明确哪些孢壁蛋白在微孢子虫感染过程中发挥了作用，不但可以了解微孢子虫的感染机制，还可以将其作为阻断感染的靶标分子，用于开发微孢子虫感染阻断试剂或药物。当前，对EHP孢壁蛋白的报道较少，JAROENLAK等［16］在2018年报道了EHP的第1个孢壁蛋白EhSWP1，推测其可能参与EHP感染；宁梓健等［17］在2020年也预测到1个含有信号肽序列的孢壁蛋白基因SWP7，但该基因表达特点还不清楚。为进一步了解EHP孢壁蛋白的特性，本研究拟对从EHP感染阳性对虾中获得的4个假设孢壁蛋白基因进行鉴定，分析它们的序列特征，并比较它们的相似性及表达规律，以期促进EHP孢壁蛋白生物学特性的解析，为EHP疾病防控提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集

疑似发病凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei，以下简称对虾）于2017年8月份取自上海青浦某对虾养殖场。随机采集外观健康的成年活体对虾样本（70日龄以上）28只，对虾体质量为4～16 g，其中16只用于虾肝肠孢虫PCR检测，6只用于孢壁蛋白基因转录组建库，6只用于孢壁蛋白基因表达分析研究。

1.2 疑似EHP感染对虾肝胰腺组织的镜检

为检测该批对虾是否存在EHP感染，取疑似EHP感染对虾肝胰腺制作湿涂片，随后用光学显微镜（LEICA，DM4B）镜检观察。

1.3 组织核酸样品提取（DNA和总RNA）

对虾肝胰腺组织DNA的提取方法参照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）的说明书。对虾肝胰腺、胃、鳃和肠4个组织的总RNA选用Trizol试剂（大连TaKaRa）进行提取。提取的核酸样品进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA样品符合实验要求后，再用超微量分光光度计（ND 5000，北京百泰克）测定核酸样品浓度，保存至-20℃条件下备用。

1.4 对虾EHP的PCR检测

本研究通过PCR检测技术进一步确认对虾样品的EHP感染状况，检测方法参照前期文献报道［16］。PCR反应采用的引物序列为EHPF1（5′-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3′）和 EHPR1（5′-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3′），模板为1.3中提取的肝胰腺组织DNA。反应体系如下（20 μL）：2 × Premix ExTaq10 μL，10 pmol·μL-1上下游引物（EHPF1和EHPR1）各1 μL，肝胰腺样品DNA模板1μL（1μg·μL-1），双蒸水7μL；PCR反应反应条件为：95℃预变性5 min；30个循环包括94℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，确定阳性样品（阳性样品出现大小为514 bp的条带）。

由图可见，水泥净浆流动度随VAc加入量增加先增大后减小；而混凝土的倒坍流空时间随着VAc的量增加迅速减少，当VAc的加入量占单体总质量的10%，流空时间最少，混凝土的粘度较低，随着疏水单体VAc的加入，表面活性效果有所增强，从而降低了混凝土的粘度。而之后继续增加VAc用量粘度却增大，这是由于在该反应体系中，VAc的反应活性明显低于其他单体，当过量时，反应体系活性较低、转化率降低，有大量的单体残余在体系中，对水泥净浆和混凝土粘度产生不利影响。

1.5 cDNA的合成

通过分析对虾肝胰腺转录组测序数据，获得4个预测结果为孢壁蛋白的基因。为验证这4个基因序列拼接的正确性，依据获得的cDNA序列，设计4对特异性引物（表1），以cDNA为模板进行PCR扩增，获取4个基因的开放阅读框（ORF）序列。为获得4个基因对应的DNA序列，选取肝胰腺组织DNA为模板，并利用上述4对引物进行PCR扩增。反应体系为：2×Premix ExTaq25 μL，10 pmol·μL-1上下游引物（EF和ER）各2 μL，cDNA模板／DNA模板2μL（1μg·μL-1），双蒸水19μL，总体积50μL。PCR反应程序如下：95℃预变性5 min；35个扩增循环（94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min）；最后72℃延伸10 min。

1.6 转录组测序及孢壁蛋白基因预测

将EHP感染中后期的对虾肝胰腺组织总RNA送至上海欧易生物医学科技有限公司进行转录组测序。核酸样品经高通量测序后，使用Trinity序列拼接软件将经双端测序的序列进行拼接，获取转录本和最终的Unigenes。将Unigenes与在线数据库（NR、SWISSPROT和KOG）进行比对并注释，筛选EHP孢壁蛋白基因。

1.7 EHP 4个孢壁蛋白基因开放阅读框序列及相应DNA序列的获取

将1.3中提取的4个组织总RNA作为模板，参照cDNA合成试剂盒（大连TaKaRa）所述方法分别进行第一链cDNA合成，反应产物保存至-20℃条件下备用。

1.8 EHP 4个孢壁蛋白基因序列测序及鉴定

将EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26的氨基酸序列进行比对，发现这4个孢壁蛋白氨基酸序列一致性为16.14%（图2）。在这4个孢壁蛋白中，EhEnP1和EhSWP7的氨基酸序列一致性最高，也仅为13.51%，表明4个孢壁蛋白相互之间的相似性很低，属于4个不具有序列相似性的蛋白。

取凡纳滨对虾肝胰腺组织进行涂片，镜检结果显示，肝胰腺组织中存在大量的微孢子虫孢子样结构，初步判断该批对虾很可能存在EHP感染。为进一步确认镜检结果，作者对该批对虾开展了EHP的PCR检测。结果如图1所示：检测的16只对虾中，有10只虾检测到目的条带，确认EHP感染阳性，阳性率为62.5%，据此判断该对虾养殖场存在严重的EHP感染。

1.9 生物信息学分析

为分析4个孢壁蛋白基因在EHP感染对虾不同组织中的表达量，本研究借助荧光定量PCR技术检测了孢壁蛋白基因在对虾肝胰腺、鳃、肠和胃组织中的表达水平。根据4个孢壁蛋白基因的cDNA序列，设计的4对特异性引物序列见表2。此外，对虾延伸因子EF-1α被选为内参基因，用于计算4个孢壁蛋白基因的相对表达量。荧光定量检测使用上述合成的第一链cDNA为模板，具体反应体系为：2×SYBR premix ExTaqTM10μL，1μmol·mL-1上下游引物（EF和ER）各4 μL，cDNA模板2μL，总体积20μL。反应程序为：95℃预变性3 min；随后进行40个循环扩增（95℃变性10 s，60℃退火延伸60 s）；最后将样品从60℃逐渐升温至95℃，每升高0.5℃检测1次荧光值，用于熔解曲线分析。用SPSS 17.0进行t检验和差异显著性分析，当P＜0.05时视为差异显著。

1.3.2 松弛疗法 指通过一定的肌肉松弛训练程序，有意识地控制自身的生理心理活动，降低唤醒水平，改善躯体及心理功能紊乱状态，达到治疗疾病的作用［10］。

笔者作为陕西农垦集团朝邑农场有限公司外派到苏垦农发新洋分公司挂职的干部，全程参加了新洋分公司2018年三秋工作。新洋分公司运用现代公司化管理模式，依靠科技创新，落实关键技术措施，发展现代农业。新洋分公司发展现代农业的公司化管理模式，值得陕西农垦借鉴学习。

2015年北海市通过开展大量的实地调研考察，对收集到的建筑工程中常见问题，有针对性地给出了解决办法，汇总编制成《北海市建设工程质量安全管理标准化图集》，用于指导施工企业按图索骥，进行标准化施工，最大限度地降低质量通病的发生，使北海市建筑工程质量整体水平得到明显的提升。特别是住宅工程中渗漏、裂缝、空鼓、空间尺寸偏差等通病得到了有效控制，投诉信访案件发生率逐年稳步下降，人民群众对住宅工程的满意度持续提高。

1.10 4个孢壁蛋白基因在EHP感染对虾不同组织的表达分析

用在线翻译软件（http：／／web.expasy.org／translate／）将EHP孢壁蛋白基因的cDNA序列翻译成氨基酸序列。用在线软件SingalP 5.0预测孢壁蛋白氨基酸序列的信号肽，并在线计算孢壁蛋白理论分子量和等电点（http：／／web.expasy.org／compute＿pi／）。用在线比对工具BLASTP分析EHP孢壁蛋白与其他微孢子虫孢壁蛋白的相似性，并用DNAMAN软件分析孢壁蛋白氨基酸序列间的相似性，以及cDNA序列中ORF区序列与对应DNA序列的一致性。

休闲制约协商更加强调人对制约因素的积极能动作用，进一步拓展了休闲制约的研究内容。当然，如何检验和测量休闲制约协商过程中的各种干预因素也成为研究难点，同时是推动研究向纵深方向发展的关键点。

2 结果与分析

2.1 镜检及PCR检测结果

二是要按照生态文明建设、保护优先和节约集约的要求来开展改革创新工作。明年工作要把改革摆在重要位置，深度全面地推进各项工作，并在原来基础上要有所拓展。

2.2 EHP 4个孢壁蛋白基因初步鉴定结果

通过转录组测序和数据分析，从EHP感染阳性对虾肝胰腺中鉴定到4个孢壁蛋白样基因，分别 命 名 为EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26。通过BLASTP在线比对发现，这4个基因编码的氨基酸序列，分别与泰国研究团队经基因组测序得到的EHP孢壁蛋白EHP00＿1402（蛋白编号：OQS54765.1）、SWP7（OQS55031.1）、SWP12（OQS53422.1）和孢子蛋白（OQS53873.1）的氨基酸序列一致。此外，我们进一步分析了4个孢壁蛋白氨基酸序列与其他孢壁蛋白序列的相似性。

图1 PCR产物的琼脂糖电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

利用qRT-PCR检测了EHP 4个孢壁蛋白基因在不同组织的表达水平，实验结果将鳃组织中各基因的表达设为1，肝胰腺中这4个基因（EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26）的表达量分别约为鳃组织表达量的118、358、1843、297倍（图3-A～D）。结果表明：这4个基因均在肝胰腺组织中表达量最高，在鳃组织中表达量最低（P＜0.05）；各基因在胃和肠组织中的表达量比较接近。提示EHP侵染的主要组织是肝胰腺。

2.3 EHP 4个孢壁蛋白基因的序列特征

进一步序列分析发现，EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26的cDNA序列全长分别为1 002、779、756、718 bp，其开放阅读框（ORF）分别为1 002、753、735、687 bp，分别编码333、250、244、228个氨基酸，预测的理论分子量分别为38.3、25.3、28.7、25.7 kDa，计算的理论等电点分别为8.86、5.04、9.05、5.12，提交的基因编号分别 为 MN604019、MN604020、MN604021 和MN604022。用SignalP 5.0在线分析4个孢壁蛋白的氨基酸序列，发现仅EhSWP7蛋白含有信号肽（第1至21位氨基酸）。在线软件SMART分析结果显示，只有EhSWP26 预测到1个MICSWaP结构域（第28至222位氨基酸）。

2.4 4个孢壁蛋白氨基酸序列的相似性分析

将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，按照核酸回收试剂盒（大连TakaRa）说明对目的片段进行回收。随后将4个核酸片段分别连接到pMD-19T载体中，并将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，对蓝白斑筛选及PCR筛选均为阳性的菌株进行增殖培养，菌液样品送至上海瑞迪生物科技公司进行测序。

2.5 4个孢壁蛋白基因的cDNA序列和基因组序列的相似性分析

进一步扩增4个孢壁蛋白基因开放阅读框对应的基因组序列，分别进行序列相似性比较，发现4个孢壁蛋白基因的cDNA序列与对应的基因组序列分别一致，结果表明4个孢壁蛋白基因对应的DNA序列中没有内含子序列。

2.6 EHP 4个孢壁蛋白基因在不同组织中的表达水平

BLASTP结果显示：EhEnP1与柑橘凤蝶（Papilio xuthus）微孢子虫EnP1样孢壁蛋白（XP＿013175528.1）的一致性为40.79%，表明两者属于同源分子，因此将该孢壁蛋白命名为EhEnP1。与此类似，EhSWP7 与中华绒螯蟹肝胞虫（Hepatospora eriocheir）的孢壁蛋白 SWP7（ORD97919.1）的一致性高达40.57%，EhSWP12与黄道蟹肠孢虫（Enterospora canceri）的孢壁蛋白SWP12（ORD93985.1）的一致性高达50.63%，故将EHP这两个孢壁蛋白分别命名为EhSWP7和EhSWP12。此外，EhSWP26与果蝇微孢子虫假定孢壁蛋白（RVD91259.1）的一致性是24.59%，与水蚤微孢子虫（Hamiltosporidium magnivorad）假定孢壁蛋白 （TBU08151.1）和 微孢子虫（Hamiltosporidium tvaerminnensis）假定孢壁蛋白（TBU01699.1）的一致性均是20.61%。从上述比对结果可发现，该类孢壁蛋白在其他物种中也没有确切的命名，由于该孢壁蛋白理论分子量为25.7 kDa，大 小 接 近26 kDa，故 暂 命 名 为EhSWP26。

2.7 EHP 4个孢壁蛋白基因在肝胰腺和胃两个组织中的表达分析

为确保实验结果的严谨性和准确性，将4个孢壁基因在2个高表达组织中（肝胰腺和胃）的相对表达量分别进行计算和比较。结果显示，在肝胰腺组织中4个基因（依次为EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26，下同）相对同一个内参基因的表达量分别为0.041、0.050、0.232和0.054，将数据标准化后，表达量如图4-A所示，它们之间的比例关系约为1∶1∶4∶1。在胃组织中，这4个基因表达量分别为0.006 4、0.01、0.016 6和0.006 2，将计算结果标准化后，表达量如图4-B所示，它们之间的比例关系约为1∶1.5∶3∶1。上述结果表明，4个孢壁蛋白基因在2种不同组织中的表达模式有一定的相似性。其中，EhEnP1和EhSWP26的表达量较为一致，表明它们在EHP的蛋白构成比例可能也相似；EhSWP7含量约为EhEnP1的1～1.5倍，表明在EHP的蛋白构成中可能前者稍高于后者或两者相似；EhSWP12的表达量约为EhEnP1的3～4倍，在这4个基因中表达量最高，由此推测EhSWP12在EHP蛋白组成中含量也高于其他3种蛋白。

图2 虾肝肠孢虫Eh EnP1、Eh SWP7、Eh SWP12和Eh SWP26的氨基酸序列比对Fig.2 Alignment of four SWP am ino acids of EHP

图3 4个孢壁蛋白基因在不同组织中的表达水平Fig.3 Expression levels of four spore wall protein genes in different tissues

图4 4个孢壁蛋白基因在肝胰腺和胃组织中的相对表达量Fig.4 Relative expression levels of four spore wall proteins genes in hepatopancreas and stomach

3 讨论

近年来，在浙江、粤西、辽宁、天津等多个对虾养殖区域均检出了EHP感染［19-23］。本研究发现，来自上海郊区的这批凡纳滨对虾EHP感染率高达62.5%，进一步表明EHP感染在我国对虾养殖区域较为普遍。由于EHP最早在泰国斑节对虾中被检测到［1］，并将其认定为微孢子虫属的一个新种［2］，这给我国研究人员提出了一个重要科学问题：在我国暴发流行的EHP与泰国流行株是否属于同一个种；此外，EHP作为一种简单真核生物，是否会像病毒、细菌等原核生物一样常因环境选择压力导致部分基因发生变异，这些问题目前还不清楚。为此，本研究通过基因克隆获取了EHP的4个孢壁蛋白基因的DNA序列，序列比较发现，它们分别与泰国当地EHP孢壁蛋白基因的DNA序列一致，这表明上海养殖场的该对虾微孢子虫和泰国当地EHP极有可能属于同一个种。考虑到4个孢壁蛋白基因的序列均没有出现变异现象，提示该真核生物具有不易受环境改变而产生基因变异的特点。此外，研究还发现这4个孢壁蛋白基因对应的DNA序列中均不含内含子，与原核生物基因组结构中不含内含子的特征非常相似，这也是早期研究将微孢子虫归为原核生物的重要原因之一，研究结果也从另一角度揭示微孢子虫属于低等真核生物。

微孢子虫的孢壁主要由孢壁蛋白和纤维状几丁质结构构成。孢壁蛋白位于微孢子虫孢子最外层，研究表明某些孢壁蛋白能与宿主细胞表面组分直接接触，参与侵染过程［14-15］。对孢壁蛋白进行鉴定并研究其生物学功能，对于阐明微孢子虫侵染机制以及其与宿主之间的关系非常重要。虽然目前EHP孢壁蛋白的研究报道较少见，但来源于家蚕、蜜蜂、蝗虫等微孢子虫的孢壁蛋白报道较多，其中家蚕微孢子虫孢壁蛋白的研究最多，有深入研究的已达10种［15，24-35］。据此推测，对虾EHP孢壁蛋白也应该有多种类别。因此对多种不同类别孢壁蛋白采取一定方式合理命名，对后续功能研究具有重要意义。在本研究之前，JAROENLAK等［16］于2018年报道了EHP的第一个孢壁蛋白EhSWP1，它有含肝素结合基序和BAR结构域，推测其可能参与EHP感染。通过序列分析，笔者发现EhSWP1与兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白EnP1属于同类蛋白，两者相似性较高且都具有肝素结合基序和BAR结构域［36］。此外，本研究也鉴定了一个EnP1样孢壁蛋白基因EhEnP1，但EhEnP1蛋白不含肝素结合基序和BAR结构域，其命名主要是基于EhEnP1与柑橘凤蝶EnP1样蛋白具有较高相似度。由此笔者认为EnP1样蛋白之间的生物学功能应该存在明显差异。鉴于目前对该类蛋白生物学功能了解有限，还需随着功能研究的深入，对该类蛋白进一步命名，避免因蛋白名称类似而混淆不同种类蛋白。由于EhSWP7和EhSWP12均能在各自BLASTP结果中找到高相似性的同源蛋白基因，因此这两个孢壁蛋白命名较为合理。至于EhSWP26，其BLASTP结果中并没有发现高相似性的已命名孢壁蛋白基因，根据未知蛋白常见命名方法，笔者依据其分子量大小（26 kDa），暂命名为EhSWP26。目前EHP孢壁蛋白功能研究报道很少，笔者通过生物信息学分析，仅发现EhSWP26包含功能域，多数孢壁蛋白功能无法预测。因此，确切命名上述孢壁蛋白还需要更深入的功能研究。

本研究通过qRT-PCR方法，分析了在EHP感染对虾中孢壁蛋白基因的表达特点，4个孢壁蛋白基因均在肝胰腺中表达量最高，表明EHP主要侵染肝胰腺组织。此外，研究还发现4个孢壁蛋白基因在胃和肠中也存在较低水平的表达，这与之前报道这2个组织也存在EHP感染的描述类似［37-41］。虽然在鳃中也检测到孢壁蛋白基因的表达，但与肝胰腺中相比，其表达量非常低，一般不认为是EHP侵染的组织。在鳃中检测到的原因可能是对虾本身开放的血淋巴循环系统携带一定量EHP或病原核酸所致。

其中i表示研究个体即西部12个省(区市)，t表示时间即从2003年到2016年，xit表示除了金融发展因素外对地区经济增长有较大影响的控制变量,包括消费、投资、政府支出、对外依存度和社会劳动力。FDit是与区间相关的依赖变量即金融发展水平。HCit是门槛变量即人力资本存量，因为人力资本水平对地区经济增长也有重要影响，在这里也把它加入控制变量之中。γ是研究中待估计的门槛值。I(°)为指标函数，其相应的括号内条件成立时取值为1，否则取值为0。μi为不随时间变化的个体效应，eit为随机干扰项。进一步地，(1)式可以转化为：

除探明了EHP侵染各组织的情况，本研究还通过比较4个孢壁蛋白基因在感染组织中表达水平，明确了EhSWP12是EHP孢壁蛋白主要组分，推测其可能在EHP侵染过程中发挥重要作用，这为EHP侵染机制等功能研究奠定了基础。虽然利用传统的蛋白鉴定方法（如双向电泳和质谱鉴定）研究结果更为直接、可靠，但在不易获取高纯度孢子的条件下，利用孢壁蛋白基因表达水平间接预测EHP蛋白构成情况，可能是探索EHP孢壁蛋白含量和组成的一种更为有效的手段。尽管存在转录后修饰等过程，对得到孢壁蛋白的真实组成情况还存在不确定性，但本研究至少提供了一些有价值的信息，如EhSWP12为EHP高含量孢壁蛋白。此外，EHP感染周期很长且感染对虾死亡率不高，暗示在EHP感染中后期，对虾体内EHP基因的表达水平相对稳定，也意味着EHP蛋白表达和组成相对平衡，这表明利用EHP感染中后期孢壁蛋白基因的表达水平推测其蛋白组成情况具有可行性。

4 小结

本研究对EHP的4个假定孢壁蛋白基因进行了序列分析和鉴定，发现其表达的4个孢壁蛋白彼此相似性很低，应属于4个不同的孢壁蛋白基因；它们与泰国当地EHP相应孢壁蛋白基因的序列一致且不易受环境影响发生突变，表明上海本地和泰国当地对虾EHP很可能属于同一个种。表达研究发现，4个孢壁蛋白基因均在肝胰腺中表达水平最高，且EhSWP12表达水平明显高于其他3个基因，表明EHP主要侵染肝胰腺组织，EhSWP12是EHP孢壁蛋白主要组分，很可能在EHP侵染过程中发挥重要作用。本研究为后期开展EHP病原生物学及感染机制研究提供了基础的数据。