不同pH 和离子强度对荞麦蛋白功能特性的影响

张雪冰，王晓闻，卢亚东，张志衡，陈振家

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801）

荞麦属禾谷类作物，在世界各地广泛种植，耐寒，在土地贫瘠的地方依然可以良好的生长，其主要有甜荞和苦荞2 种栽培品种[1-3]。荞麦营养成分丰富，荞麦蛋白含量为15%～17%。荞麦蛋白是一种天然活性成分，其赖氨酸含量较高，在降血糖、降血脂、提高人体免疫力方面发挥着重要作用[4-6]。

大量研究发现，荞麦的蛋白质含量丰富，比禾谷类含量高[7]。荞麦蛋白和大豆蛋白相似，具有良好的起泡性、乳化性、持水性等特性。荞麦蛋白的人体必需氨基酸配比合理，种类齐全，是一种全价蛋白，营养价值高[8]，具有生物保健功能[9]。荞麦蛋白有降低血液中胆固醇、抑制脂肪积蓄、改善便秘、抗衰老以及抑制有害物质的吸收等生理作用[10]。目前，荞麦加工制品主要是利用传统加工方式制成的产品，如荞麦面、荞麦粥等，且对荞麦的利用研究较少[11]。由传统加工方式制成的荞麦产品并不能完全发挥荞麦的营养价值。

本试验对荞麦蛋白功能特性及亚基组分进行研究，充分了解其加工功能特性，为更好地利用荞麦中的蛋白质提供一定的理论基础，进一步明确蛋白在食品加工中的适宜性，为开发满足消费者需要的新产品提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供试荞麦品种为晋荞2 号，由山西省农业科学院农产品加工研究所提供。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 氢氧化钠、氯化钠、盐酸、浓硫酸、石油醚、无水乙醇、甲醇均为分析纯，购买于天津市科密欧化学试剂开发中心；考马斯亮蓝G250、甲叉双丙烯酰胺、SDS、四甲基乙二胺、过硫酸铵、β-巯基乙醇、溴酚蓝、氢氧化钾、甘油、低分子量蛋白质Marker，购买于北京索莱宝科技有限公司。

1.2.2 试验仪器 DYY-7C 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；UV-1200 型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；HSJ 系列恒温水浴搅拌器（江苏科析仪器有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-III 循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；TS-2000 多用脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；HC-2064高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；高剪切分散乳化机（德国IKA 公司）；JJ-1 大功率电动搅拌器（常州国华电器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 荞麦蛋白的提取 荞麦粉碎后与石油醚按1∶5（m/V）混合，搅拌8 h 后抽滤，静置沉淀，待石油醚挥发完全后即为荞麦脱脂粉。采用碱提酸沉法将脱脂荞麦粉与蒸馏水按1∶10（m/V）混合，pH 值8.5、50 ℃恒温搅拌2 h，离心除去不溶物，上清液调pH 值至4.0，离心取沉淀，水洗沉淀3 次，回调pH至中性，冷冻干燥备用[12]。

1.3.2 不同pH 和离子强度蛋白溶液的制备 配制1%的蛋白溶液搅拌均匀后，调节溶液pH 值（2、3、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12）和称取氯化钠以配备不同浓度（0.01、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mol/L）的盐离子溶液，室温搅拌1 h 后，10 000×g 离心10 min 后取上清液。

1.3.3 荞麦蛋白溶解度的测定 采用考马斯亮蓝法测定不同pH 和离子强度的蛋白溶液浓度[13]。

1.3.4 荞麦蛋白乳化性及乳化稳定性的测定 将不同pH 和离子强度蛋白溶液转至离心管与5 mL的大豆油混合，再用匀浆机以4 档位转速将制得溶液均质2 min，静置，分别与0、30 min 时在离心管底部取20 μL 乳化液与5 mL 0.1%的SDS 溶液均匀混合，在500 nm 波长下测定吸光度值[14]。根据公式（1）、（2）计算燕麦蛋白的乳化性和乳化稳定性。

式中，A0为0 min 时的吸光度；N 为稀释倍数；c 为样品浓度（g/mL）；Φ 为乳化液中油相的比例（0.25）；L 为比色杯光径（1 cm）；A1为30 min 时的吸光度；t 为30 min（时间间隔）。

1.3.5 SDS-PAGE 电泳 依照LAEMMLI[15]的方法。浓缩胶浓度和分离胶浓度分别为5%和12%，样品上样量为5 μL。恒压电泳，电流为16 mA，浓缩胶电压和分离胶电压分别为100、150 V。电泳结束后，电泳胶片先固定3 h，再染色，脱色结束后成像仪成像。

1.4 数据处理

试验采用Excel 2010 和Origin 8.0 进行数据处理与制图。

2 结果与分析

2.1 pH 对荞麦蛋白溶解度的影响

惠丽娟[16]的研究表明，荞麦蛋白的溶解性在不同pH 条件下处理制得的曲线基本为“V”字形，即在等电点附近溶解度最低，在碱性和偏酸性条件下溶解度较好。阮景军等[17]研究发现，荞麦蛋白的溶解性在pH 值＜3.0 以及pH 值＞5.0 时，其溶解性增加。

由图1 可知，荞麦蛋白的溶解度在等电点两侧呈上升趋势，在等电点附近的溶解性较差。pH 值在2～4 时，蛋白溶解度随pH 值升高而降低，但在pH值为4.5 时有小幅度增加，pH 值在4.5～12 时，蛋白溶解度随pH 值升高而升高，pH 值在12 时达到最大。影响蛋白质溶解性的主要因素是分子间的疏水相互作用和氢键共同影响的结果[18]。疏水相互作用使蛋白质分子间相互分离，降低了蛋白质溶解度；而离子间相互作用则可以促进蛋白质与溶剂相互作用，使其溶解度提高。在等电点两侧的pH 值环境下，溶液中静电荷总量增加，离子间相互作用明显，荞麦蛋白的溶解度达到最大值；在弱酸环境下，蛋白质在溶剂中的疏水相互作用强于离子作用力，蛋白质分子疏水基团在外侧，与溶剂中的水分子相互排斥，导致蛋白质的溶解度降低。

2.2 离子强度对荞麦蛋白溶解度的影响

蛋白质的溶解性质影响其增稠、起泡、乳化和凝胶等功能特性，且蛋白质溶解性会影响其在食品中的应用[19]。从图2 可以看出，随着电解质氯化钠的加入，在盐离子浓度低于0.4 mol/L 时，荞麦蛋白的溶解度与盐离子浓度没有线性关系，较低浓度的盐离子不足以改变荞麦蛋白的溶解度；荞麦蛋白在盐离子浓度0.4 mol/L 时溶解度最大，是因为盐离子与蛋白质分子的亲水基团相结合，增强了蛋白质与水分子间的结合，从而使荞麦蛋白的溶解度增加，这种现象称为盐溶；当盐离子浓度高于0.4 mol/L时，荞麦蛋白溶解度随盐离子浓度增大而逐渐降低，这是因为过高浓度的盐溶液使得蛋白溶液出现盐析的现象，并伴随着蛋白质的析出，降低其溶解度。就整体而言，在盐离子浓度为0～1.0 mol/L 时，盐离子浓度对于荞麦蛋白的溶解度影响不大，其波动范围只有10%左右[20]。

2.3 pH 对荞麦蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

陶健等[21]研究发现，荞麦分离蛋白在碱性条件下有比较好的乳化性，在偏酸性条件下有比较好的乳化稳定性。BEJOSANO 等[22]研究表明，荞麦蛋白具有良好的乳化性。

从图3 可以看出，在pH 值为2 和12 时，荞麦蛋白有较好的乳化性；在pH 值为2～4.5 时，荞麦蛋白的乳化性大幅下降；在pH 值为4.5～6 时，荞麦蛋白的乳化性呈上升趋势；在pH 值为6～7 时，荞麦蛋白的乳化性开始下降；在pH 值为8～11 时，荞麦蛋白的乳化性基本趋于稳定；在pH 值为11～12 时，荞麦蛋白的乳化性上升到最大值。由于蛋白质的乳化能力首先取决于溶解度，溶解度越大，蛋白质与油相产生的乳化作用越明显，其乳化能力也就越大，所以，出现这种趋势的原因可能是因为pH 对荞麦蛋白溶解度的趋势也呈现这样的变化[23]。试验结果表明，荞麦蛋白的乳化稳定性随着其乳化活性的变化而变化，乳化活性越大，乳化稳定性越好。

2.4 离子强度对荞麦蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

从图4 可以看出，荞麦蛋白的乳化活性在离子强度0.01～0.1 mol/L 时增加，在0.1～0.4 mol/L 时降低，在0.4～0.6 mol/L 时增加，在盐离子浓度高于0.6 mol/L 时，荞麦蛋白的乳化活性呈降低趋势；荞麦蛋白的乳化稳定性的变化趋势与溶解度变化相一致，离子强度在0.3 mol/L 时表现的乳化稳定性最好。总体看来，盐离子浓度对荞麦蛋白的乳化稳定性的影响相对较小。

2.5 不同pH 条件下荞麦蛋白SDS-PAGE 分析

由图5 可知，非还原电泳图谱的浓缩胶和分离胶顶端出现的亚基条带和分布在43～66.2 ku 范围内的亚基，在还原电泳图谱中消失，说明这些亚基是部分小分子量亚基通过二硫键所形成。还原电泳图谱中，在31～43 ku 范围内亚基条带的增加和14.4～22 ku 范围内亚基条带颜色的加深，说明它们通过分子间或分子内二硫键形成了分子量较大的可溶性聚集体。无论是非还原电泳还是还原电泳，图谱中22～31 ku 范围的亚基条带在pH 值6～12范围内，随pH 值增加而逐渐加深，结合溶解度曲线（图1），说明这些亚基在碱性环境中溶解性更好。而还原电泳图谱中43～66.2 ku 范围内的亚基在酸性条件下颜色很浅，说明其在酸性环境中的溶解度低。由此，说明荞麦蛋白中的部分亚基含有二硫键，而且不同pH 环境中亚基的组成分布有较大差异，这是由亚基溶解度差异导致的。

2.6 不同离子强度条件下荞麦蛋白SDS-PAGE分析

从图6 可以看出，随着离子强度的增加，非还原电泳图谱中浓缩胶和分离胶顶部亚基条带逐渐消失，说明这部分亚基在高离子强度环境中溶解度较低。而在还原和非还原电泳图谱中22～31 ku 范围的亚基条带颜色逐渐加深，说明这部分亚基在高离子强度环境中溶解度呈上升趋势。由此，说明不同离子强度环境中亚基的组成分布有较大差异，但结合溶解度曲线可知，亚基分布也造成溶解度的差异。

3 结论与讨论

荞麦蛋白同其他谷物蛋白相似，均是由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和少量杂蛋白组成。但荞麦蛋白中清蛋白、球蛋白的含量较多，而醇溶蛋白和谷蛋白含量较少，这使得荞麦蛋白的组成与豆类蛋白相似。本研究通过碱提酸沉法所得的荞麦蛋白主要是由清蛋白和球蛋白组成。由试验结果可知，荞麦蛋白的溶解特性和功能特性与豆类蛋白相似，其等电点在pH 值4～5 范围内，但荞麦蛋白在高离子强度下的溶解度较好；由电泳分析结果可知，荞麦蛋白在不同pH 条件下的亚基分布相似，说明亚基溶解特性无差异性，而离子强度条件下亚基分布略有不同，这说明荞麦蛋白的高盐溶性是部分亚基造成的。

本研究结果表明，荞麦蛋白溶解度在等电点两侧呈上升趋势，当盐离子浓度为0.4 mol/L 时溶解度最大，且随着盐离子浓度的逐渐增大，其溶解度略有降低，整体而言，离子强度对于荞麦蛋白的溶解度影响不大；碱性条件下荞麦蛋白的乳化性及乳化稳定性优于酸性条件。SDS-PAGE 结果表明，荞麦蛋白的亚基主要分布在14.4～97.4 ku 范围内，且部分亚基含有二硫键；不同pH 和离子强度条件下荞麦蛋白亚基的组成有较大差异。