复方中药治疗鸡大肠杆菌病效果、机理及药物安全性初探

武怡荷，杨继业，陈书明，张希春，陈亚伟，王军艳，赵苏苏，吕 冰

（1.山西农业大学动物医学学院，山西太谷 030801；2.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西晋中 030619；3.山西省畜牧遗传育种中心，山西太原 030027）

鸡大肠杆菌是一种条件致病菌，其血清型众多，临床病型复杂，传染性强[1]。随着养鸡业的规模化，该病常造成鸡只发病死亡，使其生产性能大大降低，给养鸡业造成巨大经济损失。目前，国内外治疗用药主要有氟苯尼考、诺氟沙星等抗生素[2-3]，但存在以下缺点：（1）在畜禽产品中有害药物残留量大，导致很多食品安全问题的发生；（2）长期应用，会产生耐药菌。所以，老疫区靠抗生素等西药很难有效控制疫情，因而常有大规模的疫情发生、蔓延，给养鸡业造成致命打击。因此，研制安全、高效的防治禽大肠杆菌病的药物是当代兽医工作者急需解决的重大课题。

近年来，大量研究发现，清热类与补益类中草药可通过直接清除大肠杆菌毒素、影响大肠杆菌核酸或蛋白的合成与代谢或调节机体免疫功能治疗禽大肠杆菌病，其在临床应用中具有广阔前景[4-6]。山西农业大学动物医学学院中兽药研发团队与山西伟业生物技术有限公司合作，根据中医中药理论及多年的临床实践经验，以穿心莲、白扁豆、党参、苍术、秦皮等为基础，研制出对鸡大肠杆菌病有较好疗效的复方中药。笔者就该复方中药对大肠杆菌的抑菌效果、鸡大肠杆菌病的疗效以及鸡红细胞免疫指标的影响、药物安全性进行了初步研究，旨在探索该复方中药扶正固本，清热解毒的机制，为防治鸡大肠杆菌病中药制剂研发提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

复方中药：根据中医中药配伍原则，由穿心莲、白扁豆、党参、苍术、秦皮等配伍而成，由山西伟业生物技术有限公司提供。

实验动物：KM小鼠（18～22 g），购自山西医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（晋）2015-0001。

氟苯尼考（100 g 含氟苯尼考30 g）由广州市汇邦动物药业有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 病例来源与诊断 2020 年4 月，文水某鸡场4 周龄鸡群患病，病鸡精神不振，食欲减退，拉黄白色稀便且肛门被粪便污染，部分鸡脚麻痹，每天死亡5～6 只。剖解死亡病鸡可见，肝脏肿大变脆，腹腔中有少量黄色渗出物，肠粘膜充血、出血。采集死亡不久的完整鸡肝脏，在无菌环境中使用肝脏切面涂布普通培养基与麦康凯培养基。普通培养基生长出湿润、光滑的圆形半透明菌落；麦康凯琼脂培养基上出现圆形红色菌落；经生化鉴定试验[7]，鉴定为大肠杆菌。根据流行病学特征、临床症状、剖解病变及病原菌的鉴定，最终确诊为鸡大肠杆菌病。

1.2.2 复方中药药液的制备 取上述复方中药粉剂40.0 g，采用传统煎煮方法煎煮20 min，用无菌纱布过滤后将药液浓缩至40.0 mL，此时药液浓度为1.0g/mL。将该药液稀释，最后得到0.25g/mL、0.5 g/mL、1.0 g/mL 复方中药药液，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.3 氟苯尼考药液制备 以100 g 药对150 kg 灭菌水的比例配制，即得0.2 mg/mL 氟苯尼考药液，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.4 被分离大肠杆菌药敏试验 根据李心海等[8]使用的方法测定大肠杆菌对上述药物的敏感性。用直径为6 mm 的打孔器将定性滤纸制作成若干小圆片，高压灭菌后将其分成4 份，1 份灭菌滤纸片用0.2 mg/mL 氟苯尼考药液浸泡5 min，使每个纸片含药量为30 μg，其余3 份灭菌滤纸片分别用0.25、0.5、1.0 g/mL 相同体积的复方中药药液浸泡5 min，取出放入灭菌培养皿中干燥。使用涂布棒将菌液（1.5×108cfu/ml）均匀地涂布于营养琼脂培养基上，将标记好的4 种药敏片贴于培养基上，每种药物重复放3 个，重复4 个培养皿。37 ℃恒温培养24 h 后，测定每个药敏片的抑菌圈直径，并计算平均直径。

1.2.5 复方中药对鸡大肠杆菌病临床疗效 将文水某鸡场被确诊为鸡大肠杆菌病的830 羽病鸡随机分为5 组，对照组（30 羽鸡，不予治疗），其余分成4 组，每组200 羽鸡，分别用0.25、0.5、1.0 g/mL 复方中药药液，0.2 mg/mL 氟苯尼考药液进行饮水治疗，治疗3 d，统计治愈率、好转率、无效率及死亡率。

1.2.6 鸡红细胞C3bR 花环率、免疫复合物（IC）花环率的测定[9]根据文献[10]制备酵母菌与红细胞的菌悬液，将C3b 致敏酵母菌悬液和经药物治疗后的鸡红细胞悬液混匀，37 ℃水浴40 min，经戊二醛固定、涂片、干燥、甲醇固定后染色镜检，计算C3bR花环率。IC 花环率测定中所用酵母菌悬液不致敏，其余操作同C3bR 花环率试验。

1.2.7 复方中药安全性试验

1.2.7.1 急性毒性试验 取6 g 复方中药样品研细，过120 目筛后用蒸馏水稀释成20 mL 混悬液，药物质量浓度为0.3 g/mL。选用18～22 g小鼠20 只，随机分为2 组，雌雄各半。大部分中药及其制剂毒性较小，常难以准确测出其LD50，因此，常用最大给药量来测定试验动物对中药的耐受量[11-12]。按最大给药量20 mL/kg，计算出本研究中药给药剂量为6 000 mg/kg，经口灌胃给药，对照组予以等量生理盐水。观察动物的一般状况、中毒症状和死亡情况，观察期为14 d[13]。

1.2.7.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 根据张林等[14]提供的方法，将50 只KM 小鼠随机分为5 组，雌雄各半。按3 个剂量组（当受试药物LD50＞5 000 mg/kg 时，5 000 mg/kg 设为高剂量组，2 500、1 250 mg/kg 设为中、低剂量组）和2 个对照组（阴性对照为蒸馏水，阳性对照为环磷酰胺50 mg/kg）进行试验，计算微核率。

1.3 数据分析

将试验数据用SPSS 20.0 软件进行处理，以平均数±标准差（X±SD）表示，比较各组的差异显著性，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 复方中药与氟苯尼考对大肠杆菌的抑制作用

由表1 可知，氟苯尼考的抑菌圈直径显著高于复方中药组（P＜0.05），表明氟苯尼考的体外抑菌能力强于复方中药；复方中药对被分离的大肠杆菌也具有一定的抑菌能力，且这种能力与质量浓度大小有关，0.5、1.0 g/mL 复方中药组间抑菌圈直径无显著差异（P＞0.05），且两者显著高于0.25 g/mL 复方中药组（P＜0.05），表明0.5、1.0 g/mL 复方中药对大肠杆菌抑菌能力相当，且显著高于0.25 g/mL 复方中药。

表1 复方中药及氟苯尼考对被分离大肠杆菌的抑菌结果

2.2 复方中药与氟苯尼考对鸡大肠杆菌病的疗效

从表2 可以看出，与不予治疗组相比，使用药物治疗后，患病鸡无效率与死亡率均明显降低，0.25 g/mL 复方中药组患病鸡的治愈率与好转率最低，0.5、1.0 g/mL 复方中药组疗效优于0.25 g/mL 复方中药组，且明显优于氟苯尼考组的治疗效果。

表2 复方中药与氟苯尼考对鸡大肠杆菌病的疗效 %

2.3 复方中药与氟苯尼考对感染大肠杆菌病鸡红细胞免疫指标的影响

由表3 可知，经药物治疗3 d 后，患病鸡红细胞C3bR 花环率显著增高，其中，经0.5、1.0 g/mL 复方中药组治疗后鸡红细胞C3bR 花环率显著高于其他组（P＜0.05）；而经药物治疗3 d 后，患病鸡红细胞IC 花环率无显著变化（P＞0.05）。

表3 复方中药与氟苯尼考对感染大肠杆菌病鸡红细胞免疫指标的影响 %

2.4 复方中药的安全性试验

2.4.1 复方中药对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响 复方中药对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响如表4 所示。

表4 复方中药对小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核率的影响

微核率反映了细胞内遗传物质的损伤程度。从表4 可知，环磷酰胺阳性对照组微核率显著升高，说明本试验结果可靠。各剂量复方中药组之间无显著差异（P＞0.05），且均与阴性组无显著差异（P＞0.05），表明各剂量复方中药未对小鼠骨髓嗜多染红细胞遗传物质造成损伤。

2.4.2 复方中药对小鼠的急性毒性 经胃染毒后，小白鼠无不良反应和死亡情况。根据急性毒性剂量分级标准，小鼠经口摄入复方中药后LD50＞5000mg/kg，属实际无毒物质[15]。

3 结论与讨论

本研究选用扶正固本、清热解毒的一种复方中药对文水某鸡场的大肠杆菌病鸡进行治疗，并以氟苯尼考作为对照组，结果表明，0.5、1.0 g/mL 剂量的复方中药对患病鸡具有较高的治愈率，效果优于氟苯尼考。屈倩等[16]使用中药复方加味穿心莲散治疗35 周龄大肠杆菌病鸡，显著降低了鸡的死亡率（11.67%），但仍大于本研究中0.5、1.0 g/mL 复方中药组死亡率（均为2.0%）。在体外抑菌试验中，0.5、1.0 g/mL 复方中药组虽对分离的大肠杆菌具有一定的抑制作用，但其抑菌作用显著低于氟苯尼考组，可推测复方中药疗效优于氟苯尼考的原因不在于其抑菌作用。

近年来，研究者对穿心莲、白扁豆等做了很多研究，证明其具有抗炎、抑菌、调节免疫等作用，尤其在调节免疫方面，在现代临床上具有广泛应用[17-18]。反映红细胞膜上空位C3bR 多少的指标—红细胞C3bR 花环率的高低可反映红细胞免疫功能的强弱，而红细胞免疫功能的强弱又会影响白细胞的免疫功能。因此，红细胞膜上的受体是机体免疫的基础。本研究表明，各组红细胞IC 花环率差异并不显著，但复方中药组与对照组相比，红细胞C3bR 花环率显著升高，且随着药物剂量增加而升高。这一结果显示，本试验所用复方中药可增强感染大肠杆菌病鸡红细胞免疫功能，且与用药剂量有关，0.5 g/mL的用药剂量既经济，治疗效果又最佳。艾军[19]用固本方治疗大肠杆菌病鸡，研究发现，中药能显著增强鸡红细胞C3bR 花环率，与本试验结果相吻合。分析该复方中药的药效机理可能是：一方面抑制病原菌在鸡体内繁殖，更重要的是通过调节机体免疫功能，提高机体自身的抗病力，从而达到治疗的目的。

由于中药成分的复杂性，其化学组成研究相对薄弱，在临床应用时必须考虑到其安全性。本研究对复方中药进行了急性毒性与遗传毒性试验，该复方中药对小鼠经口摄入LD50＞5 000 mg/kg，故可以证实其属实际无毒物质。微核是骨髓内未成熟红细胞受环磷酰胺等化学诱变剂作用而发生的一种表现，微核率的高低反映了细胞内遗传物质的受损程度[20]。本研究中的复方中药对小鼠骨髓嗜多染红细胞无致微核作用，即对机体的遗传物质无损伤作用，说明其无遗传毒性。夏勇等[21]研究发现，高剂量的某复方中药制剂对大鼠有肝、肾毒性，说明中药对动物机体存在一定的毒性，因此，还需对本试验复方中药的重金属、砷等有害物质含量以及亚急性毒性做进一步研究。