普通人群间隙连接蛋白β2基因编码区突变分析▲

覃 婷 田 矛 李友琼 龙喜贵 张秀群

(广西壮族自治区人民医院医学遗传与产前诊断中心，南宁市 530021，电子邮箱：2278919254@qq.com)

间隙连接蛋白β2(gap junction protein beta 2,GJB2)基因位于13号染色体q12.11,含2个外显子，编码β2缝隙连接蛋白，在内耳毛细胞及皮肤组织中高度表达，与其他缝隙连接蛋白家族成员在细胞膜上装配形成细胞间连接通道，与细胞间的信号连接通路及离子转运相关[1]。GJB2基因突变可导致遗传性耳聋。本研究采用Sanger测序法检测普通人群的GJB2基因编码区，了解其主要突变类型。

1 对象与方法

1.1 研究对象 于2016年招募无明显听力障碍表现的200例志愿者。纳入标准：(1)研究对象之间3代之内无血缘关系；(2)同意参加本研究并签署知情同意书；(3)无日常生活中可观察到的听力障碍。排除标准：1年之内输血史或干细胞治疗病史。其中男性69例、女性131例，年龄为18～35(23.43±4.48)岁。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 标本采集 采集2 mL外周血，使用华生生物技术有限公司DNA提取试剂盒提取外周血白细胞DNA。

1.3 基因检测 将提取的DNA外送至成都博奥医学检验所，使用Sanger测序法测定所有样本的GJB2基因编码区。引物序列为：GJB2-A-F 5′TGCTTGCTTACCCAGACTCAG-3′,GJB2-A-R 5′TGGGTTTTGATCTCCTCGATG-3′；GJB2-B-F 5′GCCTACCGGAGACATGAGAAG-3′,GJB2-B-R 5′ GCGACTGAGCCTTGACAGCT-3′。在94℃，1 min→(98℃，10 s→60℃，30 s→72℃，40 s)×30个循环→72℃，10 min→10℃条件下扩增GJB2基因编码区域，产物无需纯化。根据ABI 3100测序仪使用手册，使用ABI 3100测序仪对扩增产物进行测序，采用ABI 3100分析软件(3.7NT版)分析测序结果，与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中人类GJB2基因标准序列进行比对，判读单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)及InDel位点。

1.4 突变位点临床意义的判读 通过2019年12月19日更新的Version:8.2.1版Deafness variation Database数据库(http://deafnessvariationdatabase.org/)，进行突变位点临床意义判读。

2 结 果

200例志愿者中，共84例检出GJB2基因突变(见表1)。共有9种变异体，其中2种为缺失所致移码突变，包括c.235delC、c.299-300delAT；7种为错义突变，包括良性变异4种(c.79G>A、c.341A>G、c.11G>A、c.608T>C)和致病性错义变异3种(c.109G>A、c.557C>T、c.139G>T)。 各种变异体数量及其基因频率见表2。

表1 84例GJB2基因突变者的检测结果

表2 GJB2基因突变位点及基因频率

3 讨 论

耳聋基因GJB2全长12513 bp，含2个外显子，其中编码序列全长681 bp，位于2号外显子，仅有1个开放读码框。Sanger测序可以准确检测单个或数个碱基的转换、颠换、缺失或插入，发现已知突变及未知突变位点，可用于检测GJB2基因编码序列的突变[2]。依据对蛋白产物的影响，碱基的突变可分为错义突变、移码突变、无义突变等。本研究共检出两种缺失所致的致病性移码突变c.235delC、c.299-300delAT，基因频率分别为0.50%、0.25%，与高敏等[3]在孕妇中检测到的基因频率(分别为0.95%、0.23%)基本一致，也与闻小慧等[4]在孕妇中检出的基因频率(分别为1%、0.43%)相仿。这提示，c.235delC、c.299-300delAT可能是我国普通人群GJB2基因较常见的碱基缺失所致致病性突变。

c.109G>A为最常见的错义突变，37位上的缬氨酸被同为疏水氨基酸的异亮氨酸取代，长期以来其致病性存在较多争议。王现蕾等[5]对41例c.109G>A复合致病性移码突变的儿童进行听力学评估，约60%的儿童出现轻至中度耳聋。Shen等[6]通过Meta分析发现，c.109G>A纯合子或与其他致病位点构成复合杂合突变者出现听力损失的风险高于野生型。Lin[7]等在c.109G>A突变小鼠模型中发现，内耳毛细胞周围钾离子蓄积导致对环境因素易感，可能是小鼠进展性听力下降的原因。ClinVar数据库于2019年4月24日将c.109G>A变体归类于致病性错义突变。在1000 Genomes Browsers数据库中这个位点有显著种族差异，在欧美人及非洲黑人中基因频率极低，日本东京人群基因频率为1.44%，北京汉族人群为3.88%，南方汉族人群为6.67%，而在西双版纳傣族人群中为17.20%。在未区分民族的情况下，本研究的200例无明显听力障碍者中c.109G>A基因频率为13.50%，高于1000 Genomes Browser发布的南方汉族基因频率，不除外样本偏倚所致，须后续增加样本量进一步分析。本研究在无明显听力障碍的人群中共检出10例c.109G>A纯合子，后续对其进行随访发现，其中1例(35岁)在3年间出现40 dB的听力下降，现为轻度耳聋，7例未发现听力障碍，其余2例失访。c.109G>A纯合突变者较少发生语前聋，但该突变为语后聋遗传易感高危因素，轻度的听力障碍容易被忽视[8]，因此需要加强c.109G>A纯合突变的随访，定期进行听力学检测，了解年龄相关性及听力学特点，以指导遗传咨询及听力保健。

李朔等[9]利用耳聋基因芯片对孕妇进行GJB2基因突变筛查以降低耳聋出生缺陷，但发现约有1 ∶16 000漏筛GJB2基因相关耳聋的残余风险，这是因为该芯片仅能设计4个致病位点，即c.235delC、c.299-300delAT、c.176del16、c.35delG。而本研究检出的c.139G>T、c.557G>T为罕见突变位点，未设计在芯片中，同时检出的c.109G>A突变位点因高度外显不全及多数纯合子仅表现为语后聋的遗传易感性，也不作为产前诊断预防耳聋出生缺陷的指征。由此可见，针对常见位点的孕妇耳聋基因筛查，在预防GJB2基因所致遗传性耳聋患儿出生方面存在技术局限。

c.79G>A导致27位上的异亮氨酸取代缬氨酸，c.341A>G导致114位上的带负电荷的谷氨酸被中性的甘氨酸取代，均为常见错义突变。本研究中，有3例携带3种突变位点，其中2例携带c.79G>A、c.341A>G、c.109G>A杂合子，1例携带 c.79G>A、c.341A>G、c.557C>T杂合子，提示其中至少有2个位点在基因中顺式存在，由于未行双亲检测而无法判定位点之间的相互关系。

此外，本研究中有 4例研究对象为c.79G>A、c.341A>G复合纯合子，经随访未见听力异常，结合数据库检索，判读c.79G>A与c.341A>G为良性错义突变。c.79G>A、c.341A>G基因频率分别为10.00%与8.25%，可归于编码区域的非同义SNP。值得注意的是，本研究中未检出独立存在的c.341A>G突变，33个c.341A>G突变均与c.79G>A突变同时出现。假设c.341A>G与c.79G>A反式存在，随机排列组合，c.341A>G复合c.79G>A的发生率应为0.825%，但本研究检出c.341A>G复合c.79G>A的发生率为14.5%(29/200)，提示c.341A>G与c.79G>A为顺式关系。王栋等[10]对马鞍山地区的耳聋人群基因进行研究也发现，c.79G>A与c.341A>G存在较弱的连锁不平衡。Shinagawa等[11]对GJB2基因c.235delC、c.299-300delAT、c.109G>A上下游位点构建SNP单倍体型，通过连锁不平衡分析后认为，上述位点均起源于奠基者效应并推算了大致起源时间,解释了GJB2突变的种族特异性及区域分布差异。由此可见，c.341A>G可能起源于携带c.79G>A突变个体的奠基者效应，这两个非同义SNP在不同种族及人群中的差异性有待研究。

综上所述，普通人群中GJB2基因以错义突变为主，c.109G>A在普通人群中有较高携带率，部分纯合子可无听力障碍。将针对已知突变热点的筛查用于出生缺陷预防，存在一定的漏筛风险，在检测前遗传咨询时需谨慎。