基于DNA条形码技术对朝鲜牛黄安宫丸中犀牛角成分鉴别的研究

王殿夫，齐 欣，李长征，刘洪伟，麻丽丹*，杨希国

(1.辽东学院，辽宁 丹东118000；2.大连海关技术中心，辽宁 大连 116000；3.大东港海关，辽宁 东港 118300；4.丹东海关，辽宁 丹东 118000；5.辽宁通正检测有限公司，辽宁 沈阳 110026)

0 引言

犀牛曾遍布地球，但由于偷猎及栖息地被破坏的原因，从70年代至今世界上的犀牛种群至少下降了85%[1].目前世界上仅存的犀牛共包含5个物种，即苏门达腊犀(Dicerorhinussumatrensis)，非洲的白犀(Ceratotheriumsimum)和黑犀(Dicerosbicornis)，以及亚洲的印度犀(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀(Rhinocerossondaicus)[2].犀牛角早在《本草纲目》、《神农本草经》和《药性本草》等药典中有过明确的记载，作为一种珍贵稀有的药材，具有泻火解毒、凉血止血、清心安神及治疗癌症的功效[3-7].而造成物种极度濒危状态的根源是犀牛角的珍贵[8].1977年起《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)将所有现存犀牛物种列入其附录Ⅰ的监管范围[9-10].1993年5月，我国国务院发布的《关于禁止犀牛角和虎骨贸易的通知》(国发[1993]39号)中严令禁止犀牛角的进出口及用其制药[11].近年来，由于犀牛角的稀少和珍贵使其价格飙升，犀牛的盗猎、非法贸易和走私等现象仍然有发生，更有一些不法分子为了牟取巨额利润用家畜角制品来仿制加工，以冒充真正的犀牛角[12].现市场上涉及的角骨类入药药材，由于其难以提取，造成了其鉴定工作的困难，无法配合质检、海关及公安部门的仲裁工作.因此，急需建立犀牛角制品准确、快速的鉴定方法，为各执法部门提供技术支持[13].随着分子生物学的发展，DNA条形编码(DNA Bar-coding)技术已成为一种新兴的生物分类学方法，具有广泛的应用前景，不仅不受样本形状、形态等条件限制，也逐渐被应用于珍贵药材成分的鉴定中，以建立高效的物种鉴别技术方法[14-19].同时动物角骨类药材的条形码多来自线粒体基因DNA和核基因.线粒体DNA不仅结构简单、进化速度快，还严格按照母系遗传，其控制区具有种群和个体的特异性，现已被国际上广泛地应用于物种鉴定及系统进化等领域，也是药物分子鉴定中DNA条形码的重要来源[20].其中线粒体基因组中的12S rRNA基因，就被主要应用在物种鉴定中[21].目前尚未见采用12S rRNA基因鉴定角类药材的相关报道.

朝鲜牛黄安宫丸是安宫牛黄丸的成品制剂.本研究以涉案的朝鲜牛黄安宫丸为材料，对其消化处理后提取DNA，采用12S rRNA作为DNA条形码基因片段，通过PCR扩增、测序和比对分析，用于安宫牛黄丸中犀牛角成分的真伪鉴别方法，确定了安宫牛黄丸制品准确及便捷的核酸提取和物种鉴别方法，为规范国内和口岸安宫牛黄丸制品市场的监管，打击非法贸易提供有效的技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

本研究材料来自于涉案的朝鲜牛黄安宫丸，产品共计13份.同时采用犀牛角和山羊角分别作为试验阳性和阴性对照样本.

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

考虑角制品结构坚硬造成细胞膜不容易破碎，同时朝鲜牛黄安宫丸属于深加工药材，由于经过加工处理造成DNA降解和提取工作的困难，综合以上原因需对材料进行前期消化处理.处理方法为：取检材500 mg于50 mL离心管中，加入5 mL细胞裂解液(2%CTAB、100 mmoL Tris、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、pH8.0)摇匀，充分混匀后55 ℃水浴中温和震荡消化过夜，置于65 ℃恒温箱中温育2 h.然后采用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取动物组织基因组DNA.

1.2.2 PCR引物

采用合成12S rRNA 基因序列的通用引物对L1091/ H1478[22]对各检材进行PCR扩增反应，通用引物序列如表1所示.

表1 PCR反应引物序列

1.2.3 PCR扩增反应体系及条件

每50μL PCR反应体系：5 μL 10×Ex Taq buffer(Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，0.25 μLTaKaRa Ex Taq(5 U/μL)，1 μL L1091(10 mol/L)，1 μL H1478(10 mol/L)，2 μL模板DNA，加ddH2O至50 μL.

PCR反应参数：98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40个循环；72 ℃延伸10 min.

1.2.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测

PCR 扩增反应结束后，将各PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，以DL2000 maker作为参照在凝胶成像系统下观察电泳情况.

1.2.5 PCR产物测序

使用ABI 3500基因分析仪进行测序分析.每份检材的PCR产物均进行双向测序，以保证所测序列的准确性.

1.2.6 序列分析

检材经测序后获得正反两条序列，采用DNA Star 软件(DNA Star，Inc)中的Seq Man 程序对双向测序结果进行拼接处理[23].序列使用美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)[24]中的Blast程序进行相似性分析比对，分别确定检材的基因序列号后以鉴别其物种种类.

2 结果与讨论

2.1 PCR产物电泳结果

采用12S rRNA 基因序列合成的通用引物对犀牛角、山羊角和朝鲜牛黄安宫丸扩增产物分别进行电泳后，扩增片段如图1至图3所示.从图1-3可知，犀牛角、山羊角及朝鲜牛黄安宫丸扩增产物分别得到约500 bp、450 bp和500 bp条带清晰的扩增片段.由于朝鲜牛黄安宫丸本身制品为深加工产品，再加上其成分的复杂，13份涉案的朝鲜牛黄安宫丸中只有5份检材(C-3～C-7)得到了目的性扩增片段.该通用引物L1091/ H1478对角制品类可以得到稳定、亮度高的目的片段，能满足DNA条形码技术在物种鉴定检测上的基本试验要求.

图1 犀牛角PCR扩增电泳图图2 山羊角PCR扩增电泳图

图3 朝鲜牛黄安宫丸PCR扩增电泳图

2.2 测序结果及分析

将各检材的目的片段测序后，使用NCBI 的Blast 程序分别对其进行相似性的检索及比对，只选取了各检材相似序列的5个比对结果进行了列举，结果见表2.其中犀牛角检材(A1～A8)扩增产物序列与白犀(Ceratotheriumsimum)线粒体DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可高达100.00%，同时在比对结果中也发现犀牛角检测扩增产物序列与黑犀(Dicerosbicornis)线粒体DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性达96.25%，因此，自NCBI下载白犀和黑犀物种线粒体12S rRNA全序列同犀牛角检材扩增产物序列进行比对，结果见图4，由图可以看出犀牛角检材扩增产物序列和白犀(基因序列号：Y07726.1)12S rRNA基因部分序列比对结果完全一致，而和黑犀(基因序列号：FJ608807.1)12S rRNA基因部分序列比对结果存在16个碱基的差异，说明在犀牛物种中白犀和黑犀亲缘关系很近，两者特征序列相差不大，才造成犀牛角检材扩增产物序列和黑犀12S rRNA基因序列的部分片段一致性达96.25%，犀牛角检材应为犀牛物种中的白犀；山羊角检材(B-1、B-2)扩增产物序列与山羊(Caprahircus)线粒体DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可高达99.51%；朝鲜牛黄安宫丸(C-3～C-7)扩增产物序列与非洲水牛(Synceruscaffer)线粒体DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可达98.84%.使用相似性检索及比对后，结果显示本研究收集的对照样本犀牛角和山羊角均具有较好的序列匹配度，采用12s rRNA 基因所鉴定的物种与实际收集检材一致，从而验证角制品采用12S rRNA作为DNA条形码基因片段进行物种鉴定结果的准确、可靠.在对照样本正常的情况下，5份涉案的朝鲜牛黄安宫丸与非洲水牛线粒体DNA的12S rRNA基因序列部分片段一致性大于98%可信度的一般要求，因此物种鉴定的结果为含有的是非洲水牛成分.

表2 检材中12S rRNA基因的序列相似性比对

图4 犀牛角检材与白犀、黑犀的线粒体基因组中12S rRNA基因部分序列比对图

3 结论

由于犀牛角珍贵稀有、神奇的药效和巨大的经济价值，使犀牛物种濒临灭绝.在全球范围内珍稀濒危物种非法贸易被公认为是谋取超高额利润的违法活动之一[25].中国始终支持禁止任何犀牛制品交易的禁令.因此，采用分子生物学方法精准鉴定药材中是否含有犀牛角成分，在打击非法贸易和确定物种来源的案件中具有及其重要的意义.

由于角制品本身高度角质化的特点就会增加试验提取的难度，再将其加工后微量入药，与其他中药基原成分进行混合则更会造成基因组DNA含量的减少.本研究针对上述原因对检材进行有针对性的消化处理后，采用试剂盒提取基因组DNA，已从13份涉案的朝鲜牛黄安宫丸中鉴定出5份检材是否含有犀牛角成分.说明通过对检材进行前期的消化处理过程可得到较好质量的DNA模板，提高针对角类药材物种鉴别方法的灵敏度，而针对没有得到目的扩增片段的涉案检材，如何从其复杂繁多的成分中更有效地提取DNA将作为下一步研究工作的重点.通过测序、相似性检索比对，表明采用位于线粒体上的12S rRNA基因序列的通用引物对L1091/ H1478可以准确地辨别出犀牛角制品的真伪.本研究中涉案的朝鲜牛黄安宫丸经DNA条形码技术鉴定结果为非洲水牛(Synceruscaffer)，并非使用我国限制入药的犀牛角.有研究表明水牛角和犀牛角均含有较多的Zn元素，为其可替代犀牛角提供了一定依据[26].针对角类制品及其药材制品的物种鉴别，该方法的建立可以为各执法部门相关案件的物种鉴定和量刑提供准确可靠的依据，为珍稀濒危物种的监管和打击非法贸易提供技术支持，从而更好地保护珍稀濒危动物犀牛，规范国内和口岸犀牛角制品及其药材制品的市场.