一种含铁蛋白食品在预防运动性贫血中的应用

薛亚爽

（陕西中医药大学 体育部，陕西 咸阳 712000）

0 引言

运动性贫血是体育运动过程中出现血红蛋白、红细胞水平和红细胞比积水平显著下降的一种贫血症状［1］.作为体育运动中较常见的现象，运动性贫血生理机理复杂，对运动性贫血的发生机制仍不清楚，但其中铁缺乏是导致贫血的重要因素［2-3］.铁作为必须的人体微量元素，通过参与血红蛋白的组成，构建呼吸链的重要成分［4］，也是许多蛋白质合成和酶合成的主要辅助因子，因此，铁与运动能力息息相关［5-6］.当运动训练导致铁代谢混乱时，及时检测机体早期铁缺乏状态，并给与含铁制剂补充，确保运动员训练状态十分必要［7］.目前，应用广泛的含铁制剂主要采用含铁中药等营养补充剂，该方法简单有效，效果也较好，但容易造成一系列副作用，如降低人的消化功能，导致食欲减退等［8］.因此，采用膳食补充来改善运动贫血症具有更高的安全性，成为当前的热点［9］.蚯蚓因独有的生物态含铁蛋白质与哺乳动物血红蛋白的血红素相似，具有极高的应用开发价值［10］.本文根据蚯蚓血红蛋白含铁特征，采用双水相萃取对蚯蚓血红蛋白提取、纯化，制备具有高品质的生物肽含铁蛋白质产品，并选择运动性贫血大鼠分析了功能食品对大鼠血细胞、血红蛋白、转铁蛋白等参数的影响，以期改善机体铁代谢水平.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红蚯蚓：长约6~8 cm，购自当地养殖专业户；红枣汁、蜂蜜等食品添加剂购自当地经销商；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；0.1 mol/L 的光合细菌（Photosynthetic bacteia，PSB）培养基（色谱纯，南京建成生物工厂研究所）；丙二醛测试盒（分析纯，南京建成生物工厂研究所）；血红蛋白、血清蛋白ELISA检测试剂（色谱纯，武汉博士德公司）；红细胞稀释液（分析纯，鼎国生物公司）.

1.2 仪器与设备

Pro025自动匀浆机（上海书俊仪器设备公司）；Beckman Coulter超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；DIP-1高压均质机（意大利PSI均质机公司）；Hemo Cue WBC全自动血细胞分析仪（瑞典Hemocue公司）；Multiskan酶标仪（美国赛默飞世尔Thermo公司）DWG-7A灌装机（中国航空制造工厂研究所）；Z2血细胞计数器（贝克曼库尔特有限公司）；LGJ-18S真空冷冻干燥机（上海豫明仪器设备有限公司）；DHG-9303恒温干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）.

1.3 实验方法

血红蛋白提取与纯化工艺：将蚯蚓清洗干净后，加入部分蒸馏水置于匀浆机中破碎，取离心后的上层清液，加入分子量6 000的聚乙二醇和硫酸铵达到12%（W/W），混合均匀，静置，去掉溶于聚乙二醇相中蛋白质以及非蛋白类杂质，待溶液分层后，取红色的下层血红蛋白相.将血红蛋白相沉淀，在10 mmol/L、PH为5.05的磷酸缓冲液中透析过滤，获得纯化后的血红蛋白沉淀相.取部分样品溶于蒸馏水中置于-2 ℃冷冻箱中冰冻用于制备冷冻成品，另一部分样品通过层析柱平衡液20 mmol/L、PH为7的HCl缓冲液中溶解，在1 200 r/min的离心机上高速离心，取上清液为待上柱子样品；用20 mmol/L、PH为7的HCl缓冲液平衡Q Sepharose fast flow 柱子，将待上柱子样品上柱，并制备0~800 mmol/L的NaCl洗脱液进行洗脱，收集红色蛋白部分，用于制备真空冷冻成品.

用蒸馏水将冷冻保存的血红蛋白溶解成浓度3 mg/mL溶液，根据质量比1∶1∶1的比例加入红枣汁、蜂蜜混合，调配风味（比例为血红蛋白溶液∶红枣汁∶蜂蜜），充分混合均匀后脱气处理灌装，经过超高温灭菌至室温备用.

实验对象优选：选择60只8周龄雄性Wistar大鼠，体重200±15 g.随机分为三组：对照组（20只）、跑台运动组（20只），跑台运动+营养组（20只）.运动组和运动组+营养组大鼠进行跑台训练，每日跑台训练30 min，跑台速度30 m/min.同时向两组大鼠皮下注射2%苯肼，注射48 h内大鼠未死亡，测定其红细胞含量，证明已建立贫血模型.模型建立后，两组保持运动状态，跑台运动+营养补充组大鼠每日补充自制的功能食品3次，每次2 mL，实验过程中控制饲养环境温度23±2 ℃，湿度40%~60%，自由饮食，自然昼夜节律变化光照.实验共进行12天，结束后处死所有大鼠，分离大鼠血液、血清等，进行相关指标检测.

取样检测方式：根据分组要求，在最后一次运动24 h后，由腹部主动脉取血，部分血样肝素抗凝来测定大鼠血样中红细胞数（RBC）、红细胞比积（Hct）、血红蛋白（Hb）；其余血样注入离心管，于3 000 r/min离心15 min分离血清，置于-20 ℃冷冻箱测定铁蛋白和转铁蛋白.采用ELISA法测量大鼠血清转铁蛋白，由抗凝血测定红细胞参数测定大鼠血红蛋白及血红细胞参数.训练过程中，每隔2天对三组大鼠断尾取血20 μL、采用氰化高铁血红蛋白法测定大鼠血红蛋白水平.

数据统计处理：利用SPSS10.0软件包的one-way ANOVA检验对擦剂的指标数据进行分析，数据以±标准差表示，对各指标进行相关性分析，显著性水平P<0.05，非常显著性水平P<0.01.

2 结果与分析

2.1 实验结果

2.1.1 营养物对大鼠红细胞指数影响

比较对照组、跑台运动组、跑台运动+营养组的红细胞指标指数见表1所示.可以看出，其中跑台运动组的红细胞、血红蛋白、红细胞比积均明显低于对照组、跑台运动+营养组，且对照组三相指标与跑台运动组、跑台运动+营养组表现出非常显著性意义（P<0.01）；跑台运动+营养组血红蛋白含量显著高于运动组（P<0.05），其中的血红蛋白含量、红细胞比积含量均非常显著性高于运动组（P<0.01）.

表1 不同组别大鼠的红细胞指数特征

2.1.2 营养物对大鼠血清、铁蛋白影响

相较于对照组，经过长时间跑台训练后的运动组大鼠血清铁含量显著低于对照组（P<0.05），跑台运动+营养组大鼠血清蛋显著高于运动组（P<0.05），而加入了功能食品的跑台运动+营养组的血清铁与对照组血清铁并无显著差异.长时间跑台运动导致运动组大鼠血清转铁蛋白浓度显著高于对照组与跑台运动+营养组，跑台运动+营养组的血清转铁蛋白含量稍有上升，但并不显著.可以看出，跑台运动+营养组的血清蛋白显著高于跑台运动组，而血清转铁蛋白显著低于跑台运动组（如表2）.

表2 营养物对大鼠血清、铁蛋白、转铁蛋白含量的影响

对不同组别大鼠的血清铁、血清铁蛋白与转铁蛋白进行相关性统计，见表3.其中血清蛋白与血清铁表现出显著的正相关性（R=0.533；P=0.002），血清铁蛋白与血清转铁蛋白攻读表现出显著的负相关性（R=-0.862；P=0.000），血清铁与血清转铁蛋白表现负相关性（R=-0.435；P=0.018），分析各组大鼠指标间的相关性，其中血清蛋白与转铁蛋白表现出最大的负相关性（R=-0.856；P=0.000）.

表3 大鼠各血液指标相关性结果

2.2 实验分析

2.2.1 营养干预对红细胞指数影响

分析结果表明，经过跑台运动的大鼠红细胞发生显著变化，红细胞、血红蛋白、红细胞比积指标水平显著性低于对照组.各指标的显著性下降，表明长期的跑台运动导致大鼠处于运动性贫血状态.机体红细胞数量通常是红细胞的合成和破碎速率的动态平衡决定的，当机体红骨髓内红细胞合成速率大于破碎速率，则红细胞水量和血红蛋白浓度上升，反之则下降［11］.骨髓红细胞的合成和破碎受到运动训练强度、持续时间、含氧量和身体机能状况的影响作用.运动训练中使红细胞膜脂质过氧化，溶血因子释放，红细胞破碎增强［12］.训练易造成红细胞机械性破碎，肝、脾等对红细胞破碎增加［13］.研究结果表明，经过长期跑台训练大鼠血红蛋白显著低于对照组，表明红细胞破碎速度高于生成速度，产生运动性贫血.

通过营养干预运动台大鼠可以发现，跑台运动+营养组的各项红细胞指标均显著高于对照组.长期跑台运动训练引起铁代谢紊乱，是造成运动性贫血的一个重要原因［14］.通过含铁营养物来补充改善大负荷运动下运动员铁代谢紊乱，缓解铁代谢的不利影响.本文中制备的功能食品有效提升了大鼠自身造血机能水平，维持铁代谢稳定，降低红细胞的破坏，通过协调效应达到防止运动性贫血的目的.

2.2.2 营养干预对血清铁等的影响

铁作为血红蛋白的重要组成，其与机体有氧代谢密切相关；同时，铁作为构成呼吸链的重要成分，也是能量代谢重要“催化剂”；铁是多种酶和蛋白质的组成成分，是催化物质能量代谢和形成功能物质的成分［15］.运动员在进行训练中具有高水平能量代谢，与酶的活性、呼吸链能量生成速率和机体供养密切相关，而铁在机体中具有该类生物学功能［16］.铁在机体中具有双重性，机体中含铁量充足，铁促进自由基生成而导致机体脂质过氧化，铁含量下降，影响机体红细胞生成和能量代谢水平.

血清铁作为机体中铁的主要转运形式.研究结果可以看出，高强度跑台运动造成大鼠血清铁呈下降趋势，而血清铁与骨髓造血机能密切相关［17］.跑台运动组大鼠血红蛋白浓度显著低于跑台运动+营养组，而经过功能食品干预的运动组血清铁和血红蛋白含量都高于跑台运动组，表明运动训练引起血清含量低下是影响血红蛋白合成的主要因素，高强度的跑台运动造成大鼠发生运动性贫血.

血清铁蛋白是体内铁储备的主要形式，血清蛋白浓度反应机体铁状态变化［18］.机体铁储备上升时，血清铁蛋白浓度下降.当运动引起铁丢失增加，血清铁蛋白浓度、血清铁浓度、转铁蛋白饱和度下降［19］.血清转铁蛋白是机体中转运铁的重要方式，当机体铁代谢紊乱，铁缺乏时，机体转运铁机制启动，提高摄取铁的能力，使机体转铁蛋白增加［20］.

实验结果表明经过长期的跑台运动训练导致跑台运动组血清蛋白较对照组下降了28.2%，血清转铁蛋白提高了24.6%.运动训练造成血清铁下降，血清铁蛋白耗损增加，激活了机体转铁机制，提高了机体内转铁蛋白的适应性［21］.经过干预的跑台运动+营养组相较于跑台运动组的血清蛋白上升了22.5%，转铁蛋白下降了18.2%，表明抗贫血营养剂能有效维持铁代谢机制.加入的含铁功能食品通过提升大鼠血清铁和铁蛋白浓度，降低转铁蛋白实现对铁代谢调节.通过对指标相关性分析发现：血清铁蛋白和血清铁相关性指标R=0.533，表现出显著的正相关.血清转铁蛋白与血清铁相关指标R=-0.435，表现出显著的负相关性.血清铁蛋白与转铁蛋白的相关性指标R=-0.862，表现出高度负相关性.铁蛋白、转铁蛋白与红细胞的相关性指标分别为R=-0.696和R=-0.732，表明血清铁和转铁蛋白能够较准确反应机体铁代谢水平，且血清转铁蛋白的对机体铁代谢的灵敏度更高.

3 结论与展望

以饲养的蚯蚓为原料，采用聚乙醇-硫酸铵双水相萃取的分离纯化工艺取得提取液血红蛋白，并经过透析、离心获得高品质生物肽含铁蛋白产品.将开发的含铁蛋白产品应用于运动性大鼠中，对该含铁蛋白食品在预防运动性贫血作用进行分析，研究结果表明：

（1）高负荷跑台运动造成大鼠处于运动性贫血状态，大鼠血清铁、血清铁蛋白下降，转铁蛋白上升，血清铁蛋白、转铁蛋白与血清铁变化呈现高度相关性，可通过转铁代表与血清铁蛋白表征机体代谢情况.

（2）贫血营养剂可明显提高运动性贫血大鼠的血清铁、血清铁蛋白含量，降低血清转铁蛋白含量，含铁功能食品通过改善机体铁代谢指标提高大鼠铁储备能力和铁代谢稳定性，对缺铁性贫血具有良好作用.

研究结果证实，开发的生物含铁蛋白食品在对运动性贫血方面具有良好的抗贫血功能，对于后期运动功能食品的研发层，对人类健康和体育产业发展具有实际应用价值.