两种固定液在小鼠睾丸组织HE及免疫组织化学染色中的固定效果比较

黄丽，陈炳坤，莫燕漩，郭育蓉，刘珊珊

（广州医科大学基础医学院组胚教研室，广州 511436）

小鼠睾丸组织的石蜡和冷冻切片被广泛应用于雄性生殖生物学及相关疾病的实验研究中。睾丸内生精小管和间质细胞为重要结构框架，使用常规固定液制作切片时易出现间质缺失、生精小管各层生精细胞排列紊乱等问题[1]。在完整睾丸固定脱水过程中，由于组织表面含有较厚的结缔组织被膜，不同固定液的渗透程度不同，引起组织内部固定效果差异较大，在制片过程中容易出现裂纹、细胞核皱缩、胞质空泡甚至是组织脱片等问题[2]。如需改善上述情况应严格挑选渗透力强、固定作用好的固定液。本实验观察比较两种不同固定液在HE染色和免疫组织化学染色中对小鼠睾丸组织固定效果的影响。

材料与方法

1 材料

6~8周龄雄性SPF级C57小鼠8只（睾丸16只），由广东省实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SYXK（粤）2016‐0112，体质量23~25 g。动物实验获得广州医科大学实验动物伦理委员会批准。

2 固定液的配制

Motified Davidson Fluid（mDF）：无水乙醇、甲醛原液、冰醋酸、蒸馏水按照50∶30∶15∶5的比例配制。4%多聚甲醛（4% PFD）： 将4 g多聚甲醛溶于100 mL 0.1M PBS中，加热搅拌，温度控制在60℃左右，待多聚甲醛溶解后将pH调至7.4。

3 实验分组及固定方法

将实验动物随机分为两组，每组4只。脱臼处死实验小鼠后，用眼科剪打开小鼠下腹部，眼科镊夹取脂肪垫向上提拉暴露出睾丸及附睾等结构，剪取小鼠双侧睾丸及附睾，生理盐水清洗后，立即分别投入mDF和4%PFD中进行固定，所有睾丸组织标本均在室温下固定24 h。

4 石蜡及冷冻切片制备

石蜡切片：将睾丸从固定液中取出，室温脱水，70%乙醇过夜，80%乙醇6 h，90%乙醇2 h，95%乙醇1 h，无水乙醇I 30 min，无水乙醇II 30 min，TO（生物透明剂）I 30 min，TO II 30 min，62 ℃软蜡30 min，62 ℃硬蜡30 min。浸蜡后的睾丸，按照睾丸长轴方向调整位置，62～65 ℃硬蜡包埋，蜡块经适当冷却后切片。石蜡切片使用Leica切片机切片，厚度为5 μm，40～46 ℃水浴、展片，37 ℃烤片2 h；4 ℃冰箱长期保存。

冷冻切片：将睾丸从固定液中取出，室温脱水，15%蔗糖过夜、30%蔗糖12 h。蔗糖脱水后的睾丸组织使用组织包埋剂进行包埋，‐80 ℃冰箱急冻，当组织具有一定硬度后切片。冷冻切片使用Leica冷冻切片机切片，厚度为5 μm，贴片，‐80 ℃冰箱长期保存。

5 HE和免疫组织化学染色

HE染色：切片脱蜡入水后，常规苏木素和伊红染色后梯度酒精脱水，中性树胶封固，显微镜下观察。

免疫组织化学染色：切片脱蜡入水后，枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）高压锅加热抗原修复；PBS冲洗3次；3%过氧化氢封闭15 min，PBS冲洗3次；10%山羊血清封闭45 min；加入兔抗小鼠MVH抗体（Abcam公司 ab13840，1:400稀）、兔抗小鼠SOX9抗体（Abcam公司， ab185966，1:200），4℃冰箱孵育过夜；PBS冲洗3次，每张玻片滴加100 μL HRP标记山羊抗兔IgG（中杉金桥，PV‐6001，即用型）二室温孵育1 h，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，TO透明，中性树胶封固。

6 主要观察指标

观察睾丸切片的松散程度、生精小管、间质的完整度以及生精上皮细胞的排列程度，观察支持细胞、生精细胞特异性抗原的表达程度。

结 果

1 HE染色结果比较

石蜡切片：mDF组结构完整清晰，视野中无明显空白区域，生精小管及间质部分完整，未见缺失；生精小管中各层生精细胞排列紧密整齐，胞核清晰，胞质完整；支持细胞边界不清，胞核形态典型（图1A）。4%PFD组结构较完整清晰，视野中可见明显的空白区域，生精小管结构尚完整，但部分间质成分缺失，生精细胞排列较平整，细胞结构基本清晰，但细胞间可见明显的空白裂隙（图1B）。

冷冻切片：mDF组生精小管中可见少许裂痕，各层生精细胞排列紧密整齐，胞核清晰，胞质有部分丢失（图1C）。4%PFD组生精小管中可见明显裂痕，各层生精细胞出现大量空泡化，胞质丢失，胞核收缩（图1D）。

2 免疫组化染色效果比较

石蜡切片：mDF组切片中生殖细胞标记分子MVH、支持细胞标记分子SOX9免疫组织化学染色阳性、强度和定位均较好，背景清晰，非特异性染色不明显（图2A、C）；4%PFD组切片中MVH、SOX9免疫组织化学染色均出现明显的非特异性染色，背景染色较深（图2B，D）。

图2 两种固定液石蜡切片MVH和SOX9免疫组织化学染色效果比较。比例尺，100 μmFig.2 Comparison of immunohistochemical staining effects of MVH and SOX9 expression in mouse testicular tissue paraffn section samples with mDF or 4% PDF fixation. Scale bar, 100 μm

冷冻切片：mDF组切片中生殖细胞标记分子MVH、支持细胞标记分子SOX9免疫组织化学染色阳性、强度和定位均较好，背景清晰，无非特异性染色（图3A、C）；4%PFD组切片中MVH、SOX9免疫组织化学染色无阳性反应或呈极弱阳性反应，但出现明显的非特异性染色，背景染色较深（图3B、D）。

图 1 两组固定液HE染色效果比较。比例尺，100 μmFig.1 Comparison of H&E staining effects of mouse testicular tissue between mDF and 4% PDF. Scale bar, 100 μm

图3 两种固定液冰冻切片MVH和SOX9免疫组织化学染色效果比较。比例尺，100 μmFig.3 Comparison of immunohistochemical staining effects of MVH and SOX9 expression in mouse testicular tissue frozen section samples with mDF or 4% PDF fixation. Scale bar, 100 μm

讨 论

石蜡切片和冷冻切片是临床及教学过程中最常用的制片技术，对于病理诊断及医学基础课程的示教具有重要的意义[4]。影响切片质量的因素很多，其中最关键的一项因素是组织固定程度。新鲜组织在取材后应立即投入到固定液中加以固定，以保持组织细胞的原始形态结构[5]。固定不足会造成组织溶解，结构遭到破坏；相反，固定过度也会引起组织抗原遮蔽，后期无法进行组织化学染色。因此，选取合适的固定液对于石蜡切片和冷冻切片的制作具有非常重要的意义[6]。睾丸组织表面被覆较厚的结缔组织被膜，内部组织致密，生精小管内细胞多层排列，较为密集，而间质细胞松散[7]。在制片过程中易造成生精小管内细胞收缩，胞质溶解，间质部分脱落，给临床病理诊断与生殖毒理学研究造成一定的困难。4%PFD溶液是石蜡切片和冷冻切片中科研工作中常用的固定液之一，但其在睾丸组织的切片制作中表现较差，可能与4%PFD溶液极易挥发、需加热才能溶解等性质有关，浓度不足可造成组织自溶，该现象在睾丸组织的石蜡切片和冷冻切片中均较为明显[8]。免疫组织化学标记MVH、SOX9时中均出现较明显的假阳性、较深的背景着色，可能与多聚甲醛水解后形成的缩醛基与自由氨基酸的结合进而造成抗原决定簇封闭有关[9]。mDF固定液属混合固定液，主要成分为甲醛溶液，甲醛溶液具有较好的组织固定效果，且现配现用可较好保持固定液中的甲醛浓度；另外，mDF固定液中的乙醇具备固定兼脱水功能，能够将组织中的水分去除，使组织结构完好保存[10]。冰醋酸可使组织膨胀，联合乙醇使用可抵消后者固定引起的组织高度收缩和硬化，且能加速固定，兼备快速脱水和固定作用[11]。mDF固定液组石蜡切片和冷冻切片HE染色中组织结构完整，细胞形态清晰，免疫组织化学标记PLZF、MVH、SOX9时可见阳性细胞较为突出，背景着色较浅或基本无着色。本实验中mDF固定液制作的睾丸组织切片的结构、细胞形态、胞质对比度均优于4%PFD溶液。

综上所述，mDF固定液可显著提高睾丸组织石蜡切片和冷冻切片制作的有效率，且配置简单，现配现用，节约实验时间成本，值得临床与科研推广。