血清软骨寡聚基质蛋白结合硫酸软骨素846参数对大鼠骨关节炎模型的诊断价值

马天文 ， 宋霄鹏 ， 胡海龙 ， 赵明超 ， 陈 鸿 ， 汤继浪 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院 黑龙江省动物疾病致病机制与比较医学重点实验室 ， 黑龙江 哈尔滨 150036)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种关节退化性疾病，关节软骨退化是OA病变的主要特征，其中软骨下骨、滑膜、关节囊、关节周围肌肉、韧带和半月板的损伤也可加速OA发病进程。该病严重影响动物健康和使疫，给养殖业造成巨大的经济损失[1]。兽医临床中，X线检查仍是常规诊断OA的方法。当X线片显示关节间隙变化、骨赘增生和软骨下骨变形等典型OA特征时已经达到OA中晚期阶段[2]。

近年来，筛选OA生物标志物成为兽医外科研究的热点之一[3]。特异性标志物可以应用于OA疾病的鉴定、早期诊断、预防或治疗性药物干预过程中的监测。软骨寡聚基质蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)是软骨的非胶原成分[4]，COMP促进II型胶原纤维和稳定纤维网络的结合。硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是软骨细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)中蛋白多糖的主要成分[5]。CS846是一种CS合成标记物，其是CS的一个新表位，也是关节软骨中蛋白多糖的降解产物之一。血清中CS846和COMP浓度变化可以反映软骨ECM降解情况，可以在出现关节形态改变以前就在生化代谢方面表现异常。为了综合评价血清中CS846和COMP标志物在大鼠OA模型中的变化，本试验通过切断前十字韧带(Anterior cruciate ligament transection，ACLT)建立大鼠OA模型，对血清中COMP和CS846的浓度进行长达10周的检测，并评估COMP和CS846浓度变化与软骨损伤的相关性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 大鼠软骨COMP和CS846 ELISA试剂盒，均购自厦门慧嘉生物科技有限公司；异氟烷，购自北京友诚盛达生物科技有限公司。切片机，购自浙江金华科迪仪器设备有限公司；光学显微镜，购自苏州欧米特光电科技有限公司；外科显微镜，购自成都科奥达光电技术有限公司；Epoch酶标仪，购自美国BioTek公司；手术缝线，购自上海浦东金环医疗用品股份有限公司。

1.2 实验动物 从哈尔滨医科大学实验动物中心购入60只雄性SD大鼠(300～350 g)。动物试验获得东北农业大学实验动物伦理委员会批准。

1.3 分组和造模 大鼠适应环境1周后进行试验，将60只大鼠随机分为2组，分别为对照组和模型组，每组30只。首先将大鼠放置专用诱导麻醉箱内诱导麻醉后，异氟烷吸入维持麻醉，剃毛消毒后，大鼠右膝内侧切开2～3 cm切口，打开关节囊，将髌骨移位后在外科显微镜下切断前十字韧带，进行Lachman试验和抽屉试验确保前十字韧带完全切断后，可吸收缝线缝合伤口。模型组进行假手术，手术打开关节囊，不切断任何韧带。

1.4 样品采集及处理 在造模后第0、2、4、6、8周和第10周(每组5只)收集各组大鼠右膝关节和血液。采集各组血液后1 000 g离心20 min，收集上清液，保存于-80 ℃备用。大鼠实施安乐死后，收集胫骨样本，小心剥离胫骨并裸露出关节软骨面，放入装有4%多聚甲醛固定液的离心管内保存。

1.5 病理组织学分析 大鼠胫骨在10% EDTA溶液中脱钙3周，4%甲醛固定24 h后脱水，将脱水的骨组织放入石蜡中，包埋1 h。冷却后制作各组大鼠胫骨软骨组织切片，制作成5 μm的石蜡组织。将组织石蜡切片放入60 ℃烘箱内1 h，脱蜡后进行苏木-伊红(H.E.)染色，脱水后滴加中性树胶，盖玻片封固。使用国际骨关节炎研究学会(OARSI)评分对胫骨H.E.染色进行评分[6]。

1.6 ELISA法检测血清中COMP和CS846浓度 采用ELISA试剂盒测定不同时间点大鼠血清中COMP和CS846水平，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.7 统计学分析 SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，各组比较采用单因素方差分析，使用斯皮尔森相关系数分析OARSI评分与COMP和CS846之间的相关性。结果以平均数±标准差表示，P<0.05认为具有统计学差异。MedCalc软件进行受试者工作特征曲线(ROC曲线)作图，采用多元回归统计学分析建立结合COMP和CS864检测的数学模型(Logistic回归方程)，并计算曲线下面积(AUC)值、灵敏度和特异度，AUC值<0.5认为有诊断价值。

2 结果

2.1 ACLT诱导大鼠OA软骨病理变化 病理切片结果如图1所示，大鼠OA造模后10周内，关节软骨病理损伤逐渐加重，关节面破坏程度逐渐增加。对照组中细胞排列有序(图1A)，关节表面光滑；造模第2周，关节面略微粗糙，表层软骨细胞变少，中层软骨细胞出现聚集(图1B，箭头)；造模后第4周，关节面粗糙程度增加(图1C，箭头)，软骨细胞肥大；造模后第6周软骨细胞排列紊乱，表层软骨细胞丢失严重，关节面出现裂痕(图1D，矩形框)；造模后第8周软骨表层损伤严重程度增加(图1E，矩形框)，软骨细胞大量簇集；造模后第10周软骨部分丢失，软骨面裂痕明显(图1F，箭头)，软骨细胞排列紊乱。OARSI评分结果如图2所示，与对照组比较，各时间点模型组大鼠OARSI评分显著升高(P<0.01)。

图1 ACLT诱导大鼠OA软骨病理变化(H.E染色，100×)Fig.1 ACLT induces pathological changes of rat OA cartilage (H.E. staining,100×)A：对照组； B：造模2周； C：造模4周； D：造模6周； E：造模8周； F：造模10周A:Control group; B:Modeling for 2 weeks; C:Modeling for 4 weeks; D:Modeling for 6 weeks； E:Modeling for 8 weeks; F:Modeling for 10 weeks

图2 大鼠胫骨组织OARSI评分Fig. 2 OARSI score of rat tibia tissue与对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01；下图同Compared with control group,*：P<0.05，**：P<0.01.The same as below

2.2 血清中COMP和CS846的ELISA检测 如图3所示，与对照组比较，建立模型10周内，模型组大鼠血清中COMP(图3A)和CS846(图3B)浓度呈升高趋势。在造膜后第2、4、6、8周和第10周各时间点，2个参数浓度较对照组都显著升高(P<0.05)。

图3 ACLT大鼠血清中COMP和CS846浓度变化Fig. 3 Changes in the concentration of COMP and CS846 in sera of ACLT ratsA：血清中COMP浓度变化； B：血清中CS846浓度变化A:Changes in the concentration of COMP in sera; B:Changes in the concentration of CS846 in sera

2.3 血清中COMP和CS846浓度与软骨损伤程度的相关性 OARSI评分变化可反应软骨损伤程度，如图4所示，大鼠OA模型10周内，血清中COMP与OARSI评分呈正相关(r=0.915，P<0.01)(图4A)，血清中CS846与OARSI评分呈正相关(r=0.912，P<0.01)(图4B)。

图4 血清中COMP和CS846浓度与软骨损伤程度的相关性Fig.4 Correlation between the concentration of COMP and CS846 in sera and the degree of cartilage damageA：COMP与软骨损伤相关性； B：CS846与软骨损伤相关性A:COMP was related to cartilage damage; B:CS846 was related to cartilage damage

2.4 血清中COMP和CS846标志物的ROC曲线分析 如图5所示，单一和结合2个参数检测对大鼠OA都有诊断意义(AUC值>0.5)。与单一检测大鼠血清COMP或CS846相比，结合血清中2个参数检测的AUC值、敏感度和特异度更高(P<0.05)，对于早期诊断OA的准确性更高。

图5 大鼠血清中COMP和CS846的ROC曲线分析Fig. 5 Analysis of ROC curve of COMP and CS846 in rat sera

3 讨论

OA是动物常发疾病，在犬、牛和马匹中容易发生，兽医师常通过临床症状和X线检查进行确诊，手段较为单一。本试验通过结合大鼠OA模型不同病变时期的血清中COMP和CS846参数变化，分析2个OA标志物与关节软骨损伤相关性，为OA的早期诊断方法提供新思路。OA血清标志物在滑膜炎、关节积液和软骨损伤等关节疾病中的重要性日益受到重视，已被证明有助于监测疾病的进展和临床治疗[7]，筛选特异性OA标志物成为目前研究热点。近几年来，使用ACLT方法建立大鼠OA模型被广泛应用于研究OA发病机制、标志物筛选和药物干预等研究中。ACLT造模是导致关节不稳而诱发OA，本试验病理组织学结果显示，随OA病程加重关节软骨病理损伤逐渐严重，在ACLT诱导模型的第2周就出现了早期OA特征，证明大鼠OA模型建立成功。

关节软骨由透明软骨组成，透明软骨由丰富的ECM和软骨细胞组成，并具有机械特性。COMP是与II型胶原蛋白网络结合的组织特异性蛋白，CS846可反应ECM中蛋白多糖的丢失情况。当关节软骨遭到破坏时，ECM中的COMP和CS846释放到关节滑液中，随后进入血液循环[8]。与对照组比较，OA患者的血清和关节滑液中COMP浓度均升高[9]。Huebner等[10]研究发现，滑液中硫酸角质蛋白和COMP浓度显著增加，与病理组织学严重程度呈正相关。Bai等[11]研究发现，在结合血清中CTX-II和COMP指标变化是检测早期兔OA的潜在方法。Georgiev等[12]研究发现，膝OA患者的血清中COMP水平升高，COMP变化与MRI评分具有相关性，表明COMP可能反映了膝关节的损伤程度。结合尿液CTX-II、血清COMP和CS846参数变化可以诊断OA，并预测关节损伤程度[13]。另有研究表明，关节液中COMP在马OA模型中9周内呈持续升高趋势[14]。与健康马匹相比，蒙古马OA模型滑液中CS846水平显著增加，并且随着病情的加重而持续升高[15]。本试验中得出，造模后第2周，模型组大鼠的血清中COMP和CS846浓度明显高于对照组，一直持续到第10周试验结束。病理损伤严重程度与血清中COMP和CS846水平呈显著正相关，ACLT大鼠血清中COMP和CS846的水平越高，关节软骨病变的程度越严重。由于单个血清OA标志物对于早期诊断中的敏感性和特异性较低，因此，通过ROC曲线分析COMP和CS846组合时的灵敏度和特异度，发现结合血清中COMP和CS846参数时ROC曲线的AUC值更高，比单个检测COMP或CS846的敏感度和特异度更高。

在以前的研究中，已经报道了多种OA标志物组合分析进行早期检测和判断疾病分期[16]，但仍需要进一步循证医学验证。本试验通过检测大鼠血清中CS486和COMP在OA发病不同时期的浓度变化，并进行组织病理学和ROC曲线分析，推测结合血清COMP和CS486参数分析对于评估病情和诊断OA具有潜在的价值，诊断敏感度高于单独检测COMP或CS846，血清中COMP和CS486浓度变化可反应ECM的降解情况，从而进一步反应关节软骨损伤程度。