长白山红景天多糖组分的提取纯化工艺与其免疫调节作用

马莹慧 ， 熊 馨 ， 李 月 ， 于美娜 ， 矫艳磊 ， 雷玉敏 ， 时念秋

(吉林医药学院药学院 ， 吉林 吉林 132013)

我国中药材资源丰富，其中很多中药材具有提高免疫力的作用，例如长白山红景天，别名库页红景天或者高山红景天，生长在海拔较高、气候冷凉、无霜期较短、夏季昼夜温差较大的山区。红景天属植物在全世界约有90余种，中国约有73种，东北有3种，只有长白山红景天已作药用。长白山红景天具有补益之功效，可提高免疫力，还可用于延缓衰老、治疗冠心病、心绞痛、类风湿性关节炎等疾病，已被列为国家级保健药物新资源[1]。据文献报道，长白山红景天的主要药效成分包括红景天甙类、黄酮类、多糖类、香豆素类等，其中多糖类成分有着降血糖、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等功效[2-6]。本试验从长白山红景天多糖类成分的提取着手，对提取出的粗多糖进行纯化，并对其免疫调节作用进行探究，为后续进一步将长白山红景天多糖类成分开发为保健食品提供理论依据[7-9]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 JA电子精密天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；98-1-C型数字控温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；Rotavapor R-3旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)；SHZ-D(III)循环水式真空泵(郑州市亚荣仪器有限公司)；HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；UV-1800型紫外分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)；酶标仪(美国伯乐公司)。

1.1.2 药品与试剂 长白山红景天(购自吉林大药房)；95%乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)；乙醚(天津市凯信化学工业有限公司)；丙酮(天津市津东天正精细化学试剂厂)；无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)；三氯甲烷(天津市大茂化学试剂厂)；正丁醇(天津市东丽区天大化学试剂厂)；磷酸、硫酸、苯酚(天津市永大化学试剂有限公司)；D-无水葡萄糖对照品(南京森贝伽生物科技有限公司)；MTT、 PBS、 DMSO、胎牛血清(美国Sigma)；Raw264.7细胞(上海细胞库)；Mouse IL-1β ELISA Kit和Mouse TNF-α ELISA Kit(上海酶联生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 长白山红景天长白山红景天多糖的提取 采取水提醇沉法提取长白山红景天多糖。取干燥的长白山红景天原料适量，用粉碎机粉碎后过40目筛，称取5 g并加入10倍量的水煎煮1 h，抽滤后收集滤液。将分离后得到的滤渣加入8倍量的水再次进行煎煮1 h，抽滤后合并2次所得滤液并旋转蒸发，浓缩到原来体积的1/5。使用醇沉法沉淀长白山红景天多糖浓缩液，加入95%乙醇使浓缩液中乙醇浓度达到70%，密封在10℃冰箱静置冷藏处理24 h。取出冷藏放置了24 h的样品溶液，抽滤，得到的粗多糖沉淀顺次通过无水乙醇、丙酮、乙醚溶液冲洗，并将冲洗后所得的糊状沉淀放入38 ℃烘箱中干燥。烘干后获得长白山红景天粗多糖0.48 g。经考察后使用苯酚硫酸法来测定长白山红景天粗多糖中多糖成分的含量，使用考马斯亮蓝法测定出长白山红景天粗多糖中的蛋白质成分的含量。

1.2.2 长白山红景天长白山红景天多糖的纯化 采取Sevage法来脱除长白山红景天粗多糖中的蛋白质杂质。设计L9(3)4正交试验，考察Sevage试剂体积比、料液比、离心时间、离心次数对纯化长白山红景天粗多糖的影响，以确定最优纯化方法。其中使用氯仿与正丁醇配制一定比例的Sevage试剂，与样品按照一定比例混合于离心管中，每离心1次吸出上清液，加入新Sevage试剂并继续离心，直到看不见沉淀为止，用移液枪吸出上清液并再次测定长白山红景天多糖含量与蛋白质含量，放入38 ℃烘箱中烘干备用。

1.2.3 免疫调节试验

1.2.3.1 样品溶液的制备 称取适量提取纯化后的长白山红景天多糖干燥样品，分别配制成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10、20、40、50、60 mg/mL和80 mg/mL的梯度样品溶液各3 mL；精确称量适量的MTT，在黑暗处(避光)制得浓度为1 mg/mL的黄色溶液。如不澄清则过滤备用。

1.2.3.2 细胞增殖检测 将培育后的小鼠巨噬细胞进行消化，计数，稀释至1×105个/mL并接种于96孔板。空白孔只加DMEM培养液，样品孔分别将入各浓度的长白山红景天多糖溶液，每孔200 μL。培养箱中孵育2.5 h后吸弃各孔培养液，各孔加入100 μL MTT溶液。培养箱中孵育4 h后吸弃MTT溶液，各孔加入100 μL DMSO，轻轻振荡，利用酶标仪在570 nm处测定各孔的吸光度值。

1.2.3.3 TNF-α、IL-1β含量的测定 将培养至对数期的小鼠巨噬细胞消化，计数，稀释至1×105个/mL并接种于6孔板中。空白孔只加DMEM培养液，样品孔分别加入10、20 mg/mL和50 mg/mL长白山红景天多糖溶液，每孔2 mL。培养箱中孵育48 h后吸取各孔培养液，按照Mouse TNF-α ELISA Kit和Mouse IL-1β ELISA Kit说明书操作方法用酶标仪在570 nm处测定吸光度值。

2 结果

2.1 长白山红景天多糖浓度的测定

2.1.1 标准曲线的绘制 使用苯酚硫酸法绘制标准曲线。用移液管量取1.0 g/L标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL转于玻璃试管中，加蒸馏水补至1.0 mL，每个浓度重复3次。分别向每只试管中加入6% 苯酚试剂0.5 mL，浓硫酸2.5 mL。迅速震荡均匀冷却至室温，在490 nm测定吸光度A[10]。葡萄糖溶液浓度越大吸光度越大且呈线性增长，以吸收度A为纵坐标，糖含量C为横坐标，得标准曲线y=1.249 0x-0.174 8(R2=0.993 3)，见图1。

图1 葡萄糖溶液标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose solution

2.1.2 样品溶液的测定 取浓度为1.0 g/L的样品溶液1 mL，加入苯酚试剂0.5 mL、浓硫酸2.5 mL。按标准曲线制备方法操作，测定吸收度A=0.262，根据标准曲线和样品吸光值计算含量，得长白山红景天多糖纯度为0.35 mg/mL。

2.2 考马斯亮蓝法测定蛋白质溶液标准曲线的绘制 采用考马斯亮蓝法测定长白山红景天多糖中所含有的蛋白质含量。称取考马斯亮蓝10 mg。溶解于5 mL的95%乙醇中，加入10 mL的85%磷酸，用蒸馏水稀释至100 mL，滤纸过滤备用。最终试剂中含0.01%考马斯亮蓝G-250(w/v)，4.7%乙醇(w/v)。称取牛血清白蛋白5 mg，加入1 mL蒸馏水使其成为5 mg/mL储备液，用时加水稀释至50 μg/mL备用。

分别量取50 μg/mL 蛋白质标准溶液0、0. 2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL转入玻璃试管中加蒸馏水补至1.0 mL,每个浓度重复3次，分别向每支试管中加入考马斯亮蓝试剂4 mL,迅速振荡均匀，静置5 min后在595 nm处测定吸光度A[13]。以吸收度A为纵坐标，牛血清白蛋白含量C(μg/mL)为横坐标，得标准曲线y=0.206 0x+1.304 0(R2=0.995 8)，见图2。

图2 蛋白质溶液标准曲线Fig.2 Standard curve of protein solution

2.3 长白山红景天多糖的纯化 采用Sevage法除去长白山红景天粗多糖中的蛋白质，需要考察Sevage试剂体积比、料液比、离心时间与离心次数的四因素三水平条件对去除蛋白的影响[12-13]。为使考察条件均匀分散，整齐可比且高效节约时间，设计L9(3)4正交试验如表1。其中四因素三水平分别为：A为氯仿∶正丁醇(体积比)；B为样品：Sevage试剂(体积比)；C为离心时间(min)；D为离心次数(次)，见表2。

表1 L9(3)4正交试验Table 1 L9 (3) 4 orthogonal test

表2 四因素三水平Table 2 Four factors and three levels

2.3.1 长白山红景天多糖纯化后含量测定 采用苯酚硫酸法测定纯化后长白山红景天多糖的含量，考马斯亮蓝法测定纯化后蛋白质的含量，根据长白山红景天多糖含量的增加与蛋白质含量的减少来筛选纯化的最优方案。通过测得吸光度，计算得蛋白质保留率、多糖保留率，结果见表3。

表3 纯化后测得吸光度与计算结果Table 3 Measured absorbance and calculated results after purification

比较数据可以看出第4组数据的蛋白质含量显著减少，长白山红景天多糖含量明显增加，为筛选得到的最优项，在后面的免疫调节试验中均使用以Sevage试剂5∶1、料液比3∶1、离心15 min、5次而得的长白山红景天多糖溶液。使用Sevage法纯化长白山红景天多糖后蛋白质大量减少，多糖含量增多，达到了目标效果，避免了蛋白质对细胞的影响，为免疫调节作用的研究提供了物质基础。

2.4 红景天多糖对细胞增殖的影响 本试验采用MTT法检测不同浓度红景天多糖对巨噬细胞增殖的影响[14]。使用酶联仪测得570 nm处吸光度值，结果见图3。结果表明，0.4～0.8 mg/mL红景天多糖纯化物可促进巨噬细胞的增殖(P<0.05)，而高浓度红景天多糖纯化物(1.0～10.0 mg/mL)显著促进细胞增殖(P<0.01)。提示在一定范围内，多糖溶液的浓度越高，对巨噬细胞的增殖作用越明显。

图3 红景天多糖对巨噬细胞增殖的影响Fig.3 Effect of polysaccharides on the proliferation of macrophages与对照组相比，*:P<0.05,**:P<0.01； 下同Compared with the control group, *:P<0.05, **:P<0.01.The same as below

2.5 红景天多糖对巨噬细胞分泌功能的影响 按照酶联免疫试剂盒的操作方法测定红景天多糖对巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的影响。绘制TNF-α和IL-1β的标准曲线分别为y=0.001 8x+0.035 3 (R2=0.994 4)和y=0.012 8x+0.001 8 (R2=0.992 3)，将样品溶液的吸光度值代入标准曲线，计算出的样品中TNF-α和IL-1β浓度，结果见图4。与对照组相比，当长白山红景天多糖的浓度为10 mg/mL时可促进TNF-α的分泌(P<0.05)，当长白山红景天多糖的浓度为20 mg/mL和50 mg/mL时可显著促进TNF-α的分泌(P<0.01)。长白山红景天多糖对巨噬细胞分泌IL-1β的影响更为明显，当其浓度在10～50mg/mL范围内可显著促进IL-1β的分泌(P<0.01)。表明长白山红景天多糖组分可促进小鼠巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β因子，且细胞因子的分泌量与多糖浓度成正相关，而2种细胞因子在免疫调节中均发挥重要作用。

图4 红景天多糖对巨噬细胞TNF-α和IL-1β分泌水平的影响Fig.4 Effect of polysaccharides on the secretion of TNF-α and IL-1β in macrophages

3 讨论

多糖组分作为长白山红景天的主要药效组分之一，其分离纯化过程成为研究重点。常见的提取方法包括水提取法、微波辅助法、超声提取法。其中水提取法的优点在于所需仪器设备简单，提取过程不会破坏多糖组分的结构和生理活性，而缺点在于耗费时间较长，所得多糖组分的纯度不高[15]。微波辅助法的优点在于耗时短，所得多糖组分的纯度较高，但受到仪器设备的限制，不易大规模提取[16]。超声提取法利用机械、热力等原理对多糖组分提取时不破坏其生理活性，同时具有耗时短、提取率高的优点，但同样因设备的限制，不适合大规模提取[17-18]。本试验为后续进一步开发和利用长白山红景天多糖组分，因此选择更适合大规模提取的方式——水提取法，而为了提高多糖组分的纯度，选择利用Sevage法脱除蛋白质，从而得到纯度较高的多糖类组分[19-21]。设计正交试验考察了Sevage试剂体积比、料液比、离心时间、离心次数等因素，得到最终纯化工艺为氯仿∶正丁醇为5∶1，样品溶液∶Sevage试剂为3∶1，离心时间为15 min，离心次数为5次，利用本法纯化后多糖组分的纯度达到68%，为后续研究奠定了良好的物质基础。

本试验结果对探究长白山红景天多糖组分的药理活性提供了新的思路，也为其进一步应用于抗氧化、抗衰老、调节机体免疫力等方面提供了物质支持，具有一定的科学意义和应用价值。不足之处在于药理活性的研究方面只进行了体外免疫调节试验，还需利用动物试验进一步深入研究。