3种胶体金试纸条检测羊布鲁氏菌病效果的比较

李巧玲 ， 孙佳丽 ， 彭小薇 ， 冯 宇 ， 蒋 卉 ， 范学政 ， 朱良全 ， 丁家波 ， 董 浩 ， 秦玉明

(1. 中国兽医药品监察所 ， 北京 大兴 102618 ； 2. 中国动物疫病预防控制中心 ， 北京 大兴 102600 ；3. 中国食品药品检定研究院 ， 北京 大兴 102600)

布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种危害严重的人兽共患病，该病在全世界范围流行。目前全世界已有170多个国家有人间或畜间布鲁氏菌病的报道。家畜感染布鲁氏菌病主要会引起流产和不育，而人感染布鲁氏菌病则会引起波浪热、盗汗、关节疼痛和肝脾肿大等症状，该病严重影响了畜牧业的发展和人类的公共卫生[1]。

2000年以来，由于我国家畜饲养量的增长迅速和市场交易愈加频繁等原因，我国人间和畜间的布鲁氏菌病疫情都出现了反弹。根据中国疾病预防控制中心的统计数据，2019年我国人间布病新增病例数比2018年增加了16%。2013—2017年，国家/OIE动物布鲁氏菌病参考实验室对有流产症状的非免疫牛场采集的23 381份血清样品进行检测，发现其中布鲁氏菌抗体平均个体阳性率高达44.2%[2]。

根据我国现行的动物布鲁氏菌病的诊断技术标准(GB/T18646—2018)，虎红平板凝集试验常用于家畜布病田间筛选，采用试管凝集试验、竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)和补体结合试验等方法进行确证。胶体金免疫层析法作为一种敏感性高、操作简单的快速检测方法，已被作为一种布鲁氏菌病的初筛方法纳入我国卫生行业标准《布鲁氏菌病诊断》(WS 269—2019)。但是该方法尚未被收入我国动物布鲁氏菌病的诊断标准之中。同时，尽管早期已有相关研究将胶体金免疫层析法与其他种布鲁氏菌诊断方法进行了比较，却没有对不同品牌胶体金之间进行比较的报道[3-6]。本试验分别对3种品牌的胶体金试纸条的敏感性、特异性、重复性进行了比较，同时还使用3种品牌的胶体金试纸条、虎红平板凝集试验和cELISA试验对临床羊血清样品进行了检测，较全面的对3种品牌的胶体金试纸条的检测性能进行了评估，以期为畜间布鲁氏菌病的防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 血清样品 147份羊血清采自内蒙古自治区、辽宁省和河北省的非免疫羊群。羊布鲁氏菌病标准阳性血清由国家/OIE动物布鲁氏菌病参考实验室提供。小反刍兽疫免疫阳性血清、A型口蹄疫免疫阳性血清、O型口蹄疫免疫阳性血清和山羊痘疫苗免疫阳性血清由国家/OIE动物布鲁氏菌病参考实验室保存。

1.2 试剂 布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原(批号：20200714)和布鲁氏菌病cELISA试剂盒(批号：20061901)，均购自中国兽医药品监察所；布氏杆菌抗体快速检测卡(批号：201A050100K102)，购自深圳市易瑞生物技术股份有限公司，下文简称“易瑞胶体金”；牛羊布鲁氏菌抗体一步法胶体金快速检测卡(批号：G190705308)，购自上海快灵生物科技有限公司，下文简称“快灵胶体金”；布鲁氏菌抗体金标快速检测卡(竞争法)(批号：BRU201101)，购自浙江迪恩生物科技股份有限公司，下文简称“迪恩胶体金”。

1.3 方法

1.3.1 敏感性比较 使用羊阴性血清将羊布鲁氏菌病标准阳性血清依次稀释至40、20、10、5 IU和2.5 IU，分别使用3种胶体金试纸条对上述稀释的羊血清样品进行检测，每个稀释度的血清样品进行3次重复。

按照我国动物布鲁氏菌病的诊断技术标准(GB/T18646—2018)进行虎红平板凝集试验和cELISA试验。按照3种品牌胶体金试纸条说明书的相关要求对羊血清样品进行检测。

1.3.2 特异性比较 分别使用3种胶体金试纸条对小反刍兽疫免疫阳性血清、A型口蹄疫免疫阳性血清、O型口蹄疫免疫阳性血清和山羊痘疫苗免疫阳性血清进行检测，比较三者的特异性。除此之外，使用55份cELISA检测阴性的临床阴性羊血清(国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室留存)对3种胶体金的特异性进行进一步评价。

1.3.3 重复性比较 分别使用3种胶体金试纸条对3份布鲁氏菌病阴性羊血清和3份布鲁氏菌病阳性羊血清进行5次重复检测，比较三者的重复性。

1.3.4 临床样品检测 分别使用3种胶体金试纸条、虎红平板凝集试验抗原和布鲁氏菌病cELISA试剂盒对92份临床羊血清进行检测。其中虎红平板凝集试验和cELISA试验按照国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646—2018)的相关要求开展。

2 结果

2.1 3种胶体金试纸条敏感性的比较 使用3种胶体金试纸条和虎红平板凝集抗原分别对效价40、20、10、5 IU和2.5 IU的羊血清样品进行3次重复检测，以3次均为阳性的最低检测效价为最低检测限。结果如表1所示：使用易瑞胶体金进行3次检测的最低检测限为5 IU；使用迪恩胶体金进行3次检测的最低检测限为5 IU；使用快灵胶体金进行3次检测的最低检测限为5 IU。3种胶体金试纸条的敏感性均高于虎红平板凝集试验。

表1 3种胶体金试纸条和虎红平板凝集抗原的敏感性比较Table 1 Comparative sensitivity of three colloidal gold test strips and Rose Bengal plate test

2.2 3种胶体金试纸条特异性的比较 对小反刍兽疫免疫阳性血清、A型口蹄疫免疫阳性血清、O型口蹄疫免疫阳性血清和山羊痘疫苗免疫阳性血清进行检测，结果显示，3种胶体金试纸条对上述血清样品均不发生交叉反应；对55份临床阴性羊血清(国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室留存)检测结果也全部为阴性，说明3种胶体金试纸条都具有良好的特异性。

2.3 3种胶体金试纸条重复性的比较 重复性检测结果显示，3种胶体金试纸条在对3份已知阳性羊血清的检测中均为阳性，对已知阴性羊血清的检测均为阴性。

2.4 3种胶体金试纸条检测临床羊血清效果的比较 为了比较不同胶体金试纸条对临床羊血清样品的检测效果，分别使用3种胶体金试纸条对92份临床羊血清进行检测。检测结果如表2所示，在3种胶体金试纸条中，易瑞胶体金检出了64份阳性和28份阴性样品；迪恩胶体金检出了58份阳性和34份阴性样品；快灵胶体金检出了63份阳性和29份阴性样品。

表2 不同检测方法检测临床羊血清样品的结果Table 2 Analysis of clinical sheep serum samples by different methods

虎红平板凝集试验是目前我国应用最为广泛的动物布鲁氏菌病初筛方法，同时在《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646—2018)中，cELISA试验作为动物布鲁氏菌病血清学检测的确诊方法，因此同时采用了虎红平板凝集试验和cELISA试验对上述临床羊血清样品进行了检测，结果显示，虎红平板凝集试验检测出了44份阳性和48份阴性样品；cELISA试验检测出了61份阳性和31份阴性样品。

为了进一步确定不同胶体金试纸条的检测效果，分别计算了3种胶体金试纸条与cELISA试验检测结果的符合率。结果表明，易瑞胶体金与cELISA试验的阳性符合率为90.16%，阴性符合率为70.97%，总符合率为83.70%；迪恩胶体金与cELISA试验的阳性符合率为91.80%，阴性符合率为93.55%，总符合率为93.48%；快灵胶体金与cELISA试验的阳性符合率为91.80%，阴性符合率为77.42%，总符合率为86.96%；虎红平板凝集试验与cELISA试验的阳性符合率为68.85%，阴性符合率为93.55%，总符合率为77.17%(表3)。

表3 3种胶体金试纸条与cELISA的符合率Table 3 Coincidence rates of three colloidal gold test strips and cELISA (%)

3 讨论

在动物布鲁氏菌病的检测方法中，血清学检测方法在兽医实验室中应该最为广泛。根据现行的动物布鲁氏菌病检测国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646—2018)，布鲁氏菌病的血清学检测方法主要有虎红平板凝集试验、试管凝集试验、乳环试验、间接ELISA试验、cELISA试验和补体结合试验等，而胶体金免疫层析法作为一种新型的检测方法，目前尚未收录于任何一种动物布鲁氏菌病检测的标准中。

目前，已有部分研究探讨了胶体金免疫层析法对动物布鲁氏菌病的检测效果。董浩等[7]的研究发现，使用胶体金试纸条检测羊血清样品比虎红平板凝集试验多检出了22.86%的经试管凝集试验确诊的阳性样品，由此可见，使用胶体金免疫层析法对羊血清进行检测时可以有效降低漏检的可能性。这一数据与本试验中3种胶体金试纸条敏感性均明显高于虎红平板凝集试验的结果相吻合。

李峰等[8]采用虎红平板凝集试验、胶体金试纸条、试管凝集试验和cELISA对某地区的羊布鲁氏菌病血清样品的检测结果显示，虎红平板凝集试验和胶体金免疫层析法与cELISA的符合率分别为97.0%和98.3%。欧建伟等[9]采用虎红平板凝集试验、试管凝集试验、间接ELISA、cELISA和胶体金法对牛羊血清样品进行布鲁氏菌病抗体检测，发现检测羊血清时虎红平板凝集试验和胶体金免疫层析法与试管凝集试验的符合率分别为97.78%和100%。上述文献报道的结果说明，胶体金免疫层析法的检测效果并没有明显优于虎红平板凝集试验，笔者分析这与上述试验与本试验采用方法比对的样品盘不同密切相关。在本试验中，样品盘中的血清样品中阳性样品数量和阴性样品数量基本相当，且存在大量的弱阳性样品，更利于评估不同方法间检测效果的差别。

与以往比较不同类型布鲁氏菌病检测方法的研究不同，本试验首次对不同品牌的胶体金试纸条的检测效果进行了评价，结果表明3种胶体金试纸条的敏感性、特异性和重复性都比较理想，并且在临床羊血清样品检测过程中，3种胶体金试纸条与cELISA的符合率也均高于虎红平板凝集试验与cELISA的符合率，可见胶体金免疫层析法是一种比较可靠的羊布鲁氏菌病检测方法。因此，建议相关部门尽快将该方法纳入动物布鲁氏菌病诊断的相关标准中，以提高我国兽医试验的检测能力，促进家畜布鲁氏菌病的防控。