口服枸杞多糖对小鼠肝纤维化组织基质金属蛋白酶-2及基质金属蛋白酶-2抑制剂水平影响的实验研究

韩艳珍，单铁英，李 伟，刘海平，安晓红，康瑞静，储 媛

(1.河北工程大学附属医院普外科，河北 邯郸 056002；2.河北工程大学医学院，河北 邯郸 056002；3.邯郸市中心医院护理科，河北 邯郸 056002；4.邯郸市鸡泽县医院，河北 鸡泽 057350；5.五矿邯邢职工总医院，河北 邯郸 056002)

肝纤维化是炎症因子等有害因子长期作用于肝脏组织，使肝脏组织结构反应性地出现的一种病理改变。其典型的病变特点为肝组织中有细胞坏死、组织反应性增生。如果此种病变的进程没有得到及时阻止，肝组织的损伤范围会扩大，程度会加重，肝脏的质地变硬造成肝硬化，再继续发展肝组织会癌变，此时即使采取治疗措施也将不会逆转，病情严重并且危险性高。因此，寻找能够及时有效地阻止、逆转肝纤维化的药物成为了关键所在。目前临床上干预肝纤维化的药物大多数为西药，就价格和所带来的不良反应来说，它们的使用人群没有得到较大范围的普及。近年来，中草药的应用得到了人们的重视，它具有不良反应小、取材途径较多等优点。枸杞为较常见的中草药，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)为其组成成分里的一种。现已经证实LBP对机体的功效颇多，如增强免疫细胞效能、减少氧化应激的损伤、有效抗击癌细胞的存活等[1-3]。关于LBP干预肝纤维化的效果及机制目前尚不清楚，本研究通过结扎小鼠胆总管使其肝组织发生纤维化，观察LBP干预后的效果并总结其机制，为阻止和逆转肝纤维化探索新的防治策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物来源：18只雄性57BL-6小鼠由河北医科大学组胚教研室赠送，平均周龄(5.00±1.36)周，平均体重(0.32±0.28)kg。许可证号：SCXK(冀)2019-2-011。

1.1.2 主要试剂：枸杞多糖[卫食健字(2000)第0034，武汉广夏枸杞开发有限公司]，口服时用三蒸水溶解调制。基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基质金属蛋白酶-2抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)第一抗体(批号：CD-109273GM)由武汉纯度生物科技有限公司提供。羟脯氨酸试剂盒(批号：FT-T2774)由上海梵态生物科技有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 建立肝纤维化病变模型及分组：选12只小鼠从腹中线剪开，无菌环境中分离并结扎胆总管，造成小鼠肝组织发生纤维化病变，然后平均分配入2笼，分别为肝纤维化组和LBP组，再选1笼正常小鼠(6只)为对照组。LBP组服用含LBP 25 μg/L的三蒸水200 ml，对照组和肝纤维化组仅服用三蒸水200 ml，1次/d，连续服用30 d。第31天抽取各组小鼠的腹主动脉血液，经过离心得到血清后冷藏待检测。

1.2.2 肝功能指标检测：将各组小鼠的血清放入生物化学仪器中分析谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平。

1.2.3 肝组织切片制备并HE染色：干预完毕后切取约1 cm×1 cm×1 cm肝脏组织块，浸没到甲醛液体中以保存其生活状态结构，用酒精置换出组织块中的水分，用二甲苯溶液增强其透光性，再投入石蜡溶液中，冷却后上机切割为5 μm薄片，铺展于载玻片上，晾干。先将粘有组织薄片的载玻片依次浸入二甲苯液、乙醇浓度逐渐降低的溶液中，然后浸入蒸馏水中，最后浸入碱性苏木精、酸性伊红里上色，铺上盖玻片，晾干。

1.2.4 MMP-2和TIMP-2 Western blot检测：将每组小鼠的肝组织研为浆液，分离浆液中的蛋白质，取出少量的蛋白质按照说明书的步骤依次经过变性、加入浓缩胶中、放入电泳槽中电泳、分离胶块、将胶块中的蛋白条带转入膜中。膜封闭后，先后用MMP-2和TIMP-2的一抗液、有标记的二抗液孵育，膜清洗后放入暗室中显影于X线片上并定影，采用图像软件分析其灰度值并计算相对表达量[以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内参]。

2 结 果

2.1 三组小鼠肝组织结构比较 见图1。正常组肝脏里的每个小叶结构分界清楚，其中央为中央静脉。肝纤维化组肝脏中有轻重程度不一、面积大小不同的组织坏死，小叶轮廓不清，只见结缔组织范围扩大，内含数量较多的小叶间胆管。LBP组肝组织坏死程度减轻，坏死面积也有所减小，结缔组织范围缩小，其内的小叶间胆管数目变少。

A:正常组 B：肝纤维化组 C:LBP组

2.2 三组小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平比较 见表1。与正常组比较，肝纤维化组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平均升高(均P<0.05)。与肝纤维化组比较，LBP组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平均下降(均P<0.05)。

表1 三组小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平比较(U/L)

2.3 三组小鼠MMP-2、TIMP-2相对表达量及MMP-2/TIMP-2比较 见表2(图2)。与正常组相比较，肝纤维化组MMP-2的相对表达量略微上升(P>0.05)，TIMP-2的相对表达量升高明显(P<0.05)，MMP-2/TIMP-2下降(P<0.05)。与肝纤维化组比较，LBP组MMP-2相对表达量升高，TIMP-2相对表达量下降，MMP-2/TIMP-2上升(均P<0.05)。

表2 三组小鼠MMP-2、TIMP-2相对表达量及MMP-2/TIMP-2比较

图2 三组小鼠MMP-2与TIMP-2 Western blot检测

3 讨 论

枸杞子属于一种茄科植物，早已被中国传统医学列为具有滋补功效的中草药，现已被广大人群用作滋补保健品。LBP是其成分中的一种水溶性物质，不仅含有多种单糖，而且还含有其他的营养物质[4]。研究[5-8]表明，LBP具有提高机体中免疫细胞活性、削弱氧化应激造成的组织损伤、拮抗恶性肿瘤细胞在机体中的生存、通过降低炎症反应部位的生物学因子活性或数量来阻止损伤作用等多种生物学功效。肝脏纤维化病变的发生、发展与炎症因子的长期不良作用密切相关[9]，因此本研究观察LBP对肝纤维化损伤是否具有改善作用，并探究其作用机制。

本研究通过结扎胆总管使胆汁通路受阻，导致肝脏组织出现纤维化病变。因为肝细胞产生的胆汁逐渐增多并淤积在结扎以上的肝脏中大小不同的胆管里，肝脏期初会反应性地通过扩大胆管管腔和增加其数量来缓解病情的进展，但是这种缓解能力有限，胆汁的继续增多会冲破胆管流入至肝组织中，压迫组织中的营养血管，使其不能为肝细胞提供营养，进而导致肝细胞缺血、坏死，血液里的炎性细胞会游走到坏死组织中，坏死部位周围的结缔组织会反应性增生，造成肝组织结构紊乱不清。此种依靠胆汁通路不畅引起的小鼠肝纤维化病变的实验操作简单易行，模型制作的合格率较高[10]。

肝组织由肝细胞缺血、坏死到组织炎症反应，进而出现肝组织中细胞外间质成分增生且含量增多，其中数量显著增多的是间质中的胶原纤维。健康的肝组织中胶原纤维的分泌与分解保持着平衡稳态，此种稳态主要通过两种相互拮抗的酶——MMP和TIMP的水平来决定，两者比值的升高或者降低对间质含量起着关键性的作用[11-13]。引起肝纤维化病变的关键是肝星状细胞的数量和活性增加。动物研究[14-15]证明，肝纤维化组织中MMP-2的含量上升，MMP-2可以分解Ⅳ型胶原等间质成分，破坏肝血窦的基底膜结构，也可增加肝星状细胞的活性，加重肝纤维化的病情。TIMP-2为MMP-2的拮抗剂，可以和MMP-2特异性结合而降低其活性。

本研究结果表明，正常肝脏里MMP-2和TIMP-2含量均较少，当肝发生纤维化病变时MMP-2含量略微增加，而TIMP-2含量增加较明显，MMP-2/TIMP-2降低。与肝纤维化组比较，LBP组肝脏内的MMP-2含量明显增加，TIMP-2含量明显减少，且两者比值明显升高。从这些数据可以看出，衡量肝纤维化病程进展不能仅依赖MMP-2或者TIMP-2含量，而是要看两者比值。在肝纤维化时，MMP-2/TIMP-2降低，可以说明虽然两者含量均升高，但TIMP-2升高幅度高于MMP-2，造成间质含量增加而纤维化加重。服用LBP后，MMP-2含量继续增加而TIMP-2含量有所减少，MMP-2/TIMP-2升高，此时MMP-2的作用才能显现出来，使间质成分降解，减轻纤维化以保护肝组织。