野生山樱桃花芽分化进程及开花物候的研究

杨 楠 ，聂江力 *，辛 微 ，裴 毅 ，石福臣

（1.天津农学院园艺园林学院，天津 300384；2.南开大学生命科学学院，天津 300071）

山樱桃（Cerasus serrulata），别名山樱花，是蔷薇科（Rosaceae）李亚科（Prunoideae）樱属（Cerasus）多年生落叶乔木，树干颜色为灰褐色，枝条颜色为灰白色或褐色。山樱桃群体花期在4—5 月，花序呈伞形，有2～4 朵花。山樱桃总苞片为褐红色，苞片为褐色或淡褐色。山樱桃花有5 片花瓣，颜色多数为白色，少数略带淡粉色，花瓣顶端具凹缺；花萼5 片，绿色，被绒毛；果实为核果，椭圆形，状似小型樱桃[1]。山樱桃树型优美，开花时花繁而艳丽，具有较高的观赏价值，能够美化环境，在预防水土流失、调节生态系统小气候和改善空气条件等方面也有很好的效果[2]。相对于其他樱属植物，山樱桃花期较长，生态适应性和抗逆性强，并能够正常进行受精结实的生殖过程，经常用作关山樱、八重山樱等樱属植物嫁接的砧木或接穗，是一种分布较为广泛的园林乔木树种[3-4]。

在园林生产中，果树结果的大小年现象、低树龄果树提前结果和果实品质的改良等都与植物的开花物候和花芽分化过程有关，对果树花不同时期的情况进行详细的研究，对于准确控制适宜的施肥浇水时间十分重要[5]。同时，对植物属种类群的划分的研究、新品种的栽培选育和果树花期的调控，也需要以植物开花物候和花芽分化进程作为依据[6]。果树的开花物候和花芽分化在整个生命期中占据着重要的地位，是果树生殖特性研究中不能缺少的一部分[7]。作为果树的生活史特征，开花物候和花芽分化会对果树的繁殖成功与否和对环境的适应程度产生一定的影响，同时更能直接影响开花后的传粉受精等生殖过程[8]。近些年，有许多学者使用石蜡切片、实体解剖、扫描电镜和透射电镜观察等方法观察研究了植物的花芽分化过程[9-10]。但关于野生山樱桃花芽分化的研究尚未见报道。因此，该研究以天津地区发现的野生山樱桃为材料，通过野外观测与室内试验结合，对其开花物候期和花芽的分化现象进行了研究。希望通过相关试验获得关于野生山樱桃开花物候和花芽分化的相关结论，探究其生长过程中是否出现异常现象，进而掌握野生山樱桃的开花物候和花芽分化过程。以期为天津地区樱属植物的栽培育种和进一步研究开发野生山樱桃种质资源和樱桃水果改良等技术问题积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。山樱桃（Cerasus serrulate）采集地位于天津市蓟州区八仙山自然保护区。

1.1.2 试剂与仪器。FAA 固定液配方如表1 所示，乙醇，爱式苏木精染液，二甲苯，石蜡，番红，固绿，树胶，转轮式切片机，Leica-DM4000 显微镜等。

表1 FAA 固定液配方

1.2 方法

1.2.1 试验材料的固定。从2019 年7 月5 日山樱桃花芽萌发到2019 年10 月30 日，每3 d 采集有芽鳞片包裹的花芽1 次，每次5 个，选用 FAA 作为固定液，将去除外部鳞片的花芽放入固定液中存放。

1.2.2 石蜡切片的制作。采集的试验材料用FAA 固定24 h 以上后，取出材料依次放入50%和70%乙醇浸泡3 h，将材料放置在爱氏苏木精稀释染液中整染3 d。整染后取出材料用蒸馏水漂洗至不再出现蓝紫色后进行脱水，依次用30%、50%、70%、85%、95%以及100%乙醇分别浸泡3 h 进行脱水，其中100%乙醇浸泡2 次。脱水后的材料仍然放置于100%乙醇中，用1/5 二甲苯（吸出瓶内1/5 试剂，再加入1/5 二甲苯）、2/5 二甲苯、3/5 二甲苯、4/5 二甲苯和纯二甲苯（2 次）依次浸泡3 h，对材料进行透明处理。在装有透明好的材料的二甲苯溶液中加入碎蜡（36℃培养箱中），注意少量多次并放置过夜。

第2 天取出用二甲苯和石蜡充分浸泡的材料依次用50%石蜡（40℃～42℃恒温箱） 和70%石蜡（48℃～50℃恒温箱）浸泡1 h，纯石蜡（58℃恒温箱，3次）浸泡30 min。将经过纯石蜡浸泡的材料进行包埋，并在蜡块凝固后将其修整成为适宜大小的正方体并用LEICA RM2265 切片机进行切片，切片厚度设定为8～9 μm。切片完成后取完整清晰的蜡带用粘片剂粘在载玻片上，放置展片台上展开后于36℃烘箱中烘干。烘干完成后用纯二甲苯和1/2 二甲苯浸泡，然后将 100%、95%、85%、70%、50%、30%乙醇依次滴在载玻片上停留5 s，用番红固绿染色并用树胶封片。

1.2.3 显微镜观察。在Leica-DM4000 显微镜下观察目的细胞并拍照。

1.2.4 开花物候期观测。开花物候期的观察过程中不同物候期的划分方法如下，见表2。

表2 开花物候期划分方法

2 结果与分析

2.1 开花物候期观测

生长在天津市蓟州区八仙山自然保护区的野生山樱桃群体于4 月初进入露瓣期，持续4 d 左右，4月中旬进入始花期，随后山樱桃群体开始大量开花，4 月末植株进入落花期，整个花期持续1 个月左右。单株花期持续约11～14 d，不同山樱桃单株之间没有明显的物候差异。

2.2 花芽分化

通过对野生山樱桃的生长周期观察发现，其花芽在7 月初开始分化，过程主要由花芽分化初期、花序原基分化期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期这6 个时期组成。

2.2.1 花芽分化过程中大小变化。从7 月5 日开始用游标卡尺测定花芽膨大处的直径和长度，由表3可知，野生山樱桃的花芽在7 月5 日的平均长度为2.74 mm，平均直径为1.15 mm，整个分化过程中，花芽不断膨大并伸长，至10 月5 日时，平均长度伸长为7.44 mm，平均直径膨大为4.37 mm。

表3 野生山樱桃花芽外部形态测量

2.2.2 花芽分化初期（7 月初）。山樱桃分化初期花芽较小，外部被鳞片包裹，处于未分化时期的花芽，观察纵切面发现，形状近似锥形，花芽生长点顶端微凸，短小、先端圆钝，由很多体积小排列紧密的初生分生细胞组成。此时，表皮细胞下的原套细胞和原始细胞中没有发现细胞分裂现象（图1-1）。当花芽开始分化，生长点顶端的分生细胞开始分裂，进入花芽分化初期。

2.2.3 花原基分化期（7 月25 日左右）。随着花芽分化的开始，山樱桃的花芽顶端开始膨大。位于生长点底部表皮下方的细胞，即原套细胞和原始细胞进行了平周分裂形成向上的花苞片原基的突起（图1-2）。苞片原基的突起逐渐分化生长，生长点顶端的微凸逐渐变平缓，接近半圆形，进入花原基分化期。

2.2.4 萼片原基分化期（8 月15 日左右）。花芽分化形成花原基后，生长点底部细胞继续进行平周分裂，花原基继续进行伸长发育，同时花原基顶端逐渐变得平坦，由于花原基内外细胞的分裂速率不同，导致花原基顶端中间部位出现凹陷，四周相对突起，突起部分即为花萼原基（图1-3）。从切片可以观察到，花原基顶端细胞体积较小，染色较深。此时，花芽继续膨大，花芽分化进入花萼原基分化期。

2.2.5 花瓣原基分化期（9 月20 日左右）。花芽内产生花萼原基后，细胞继续分裂。花原基的凹陷变平坦并增宽，四周突起的花萼原基继续伸长变细并向花芽内侧微微弯曲。此时，花萼原基基部内表皮下侧的分生细胞持续进行细胞分裂，形成突起，这一突起顶端的分生细胞快速分裂进行伸长生长，进而形成花瓣原基（图1-4），最终发育成花瓣。此时，花芽持续膨大并伸长，分化进入花瓣原基分化期。

2.2.6 雄蕊原基分化（10 月10 日左右）。在花萼原基和花瓣原基进行分化的同时，花原基中央仍然保持平坦，花瓣原基底部内侧的细胞开始进行细胞分裂并形成突起（图1-5），这一突起即为雄蕊原基。雄蕊原基的突起表面细胞持续进行快速的平周分裂，使雄蕊原基逐渐伸长，最终会发育形成花药和花丝。此时，花芽伸长膨大，直径达到3.48 mm，花芽分化开始进入雄蕊原基分化期。

2.2.7 雌蕊原基分化（10 月25 日左右）。雄蕊原基形成后，突起上的细胞继续分裂产生更多的突起，并进行伸长生长最终形成雄蕊群。与此同时，位于花原基中间的细胞分裂形成突起，这一突起即为心皮原基。心皮原基顶端的细胞发生快速分裂使其逐渐向上突起（图1-6），而后细胞继续进行分裂使心皮原基持续向上伸长，最终形成柱头、花柱和子房。此时，花芽直径膨大至4.37 mm 左右，花芽分化处于雌蕊原基分化期。雌蕊分化完成后，花芽分化过程结束。

图1 野生山樱桃花芽分化观察

3 讨论

3.1 野生山樱桃花芽形态分化

植物的花芽分化是一个复杂的变化过程，各个分化阶段之间没有明显的界限。为了方便研究，以花芽中组织生长状态为依据，将这一过程划分为不同时期。对于不同种类的植物，花芽分化阶段的划分也有所区别[11]。在该研究中，通过石蜡切片观察，从果实成熟时期开始，将山樱桃花芽分化过程分为花芽分化初期、花原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期以及雌蕊原基分化期6个阶段，分化过程主要发生在7—10 月。

通过石蜡切片观察发现，野生山樱桃花芽分化初期，花原基分化期，萼片原基分化期和花瓣原基分化过程与部分樱属植物花芽分化研究结果相似[12-14]。但不同种类植物分化时间有一定的区别，浙江短柄樱桃花芽分化时期从7 月15 日持续到10 月末[12]，而陕西马哈利樱桃的花芽分化期集中在7—8 月，这可能是受生长地温度气候等条件的影响。

在雄蕊形成的过程中，首先在花原基周围出现少量突起，为雄蕊原基，之后这些突起逐渐增多，分裂成为更多的雄蕊，并最终发育成雄蕊群，分化完成的花丝基部与花冠基部联合。雄蕊原基形成后，花原基中央的心皮原基开始突起分化形成雄蕊原基。有研究发现，部分樱桃[14-16]和杏[17]雌蕊分化过程中会产生回拢现象，但是在该研究中，并未发现这种现象。

野生山樱桃从7 月初开始至10 月末结束，整个花芽分化过程持续时间较长，同一株植物上的花芽能观察到小部分花芽所处分化时期不同，大部分花芽分化进程时间接近。且在分化过程中，花芽长度平均从7 月初开始由2.92 mm 伸长至5.73 mm，花芽前段直径由1.24 mm 膨大4.37 mm。因此从花芽分化开始，基本可以以时间差为基准，同时观察花芽大小，采集花芽观察分化过程。

3.2 野生山樱桃冬季休眠期花芽发育

10 月末野生山樱桃花芽分化过程结束后，花器官仍然继续发育。11 月中旬，随着气温下降，山樱桃植株进入休眠期，花芽内花器官的分化发育基本停止，结构没有发生明显变化。到次年3 月下旬，气温回暖后，胚珠原基和小孢子母细胞继续分化发育成相应的花器官。关于樱属植物花芽分化过程的研究报道较多，北京地区樱属植物大岛樱花芽分化从7月下旬开始，到11 月下旬结束进入休眠期，在次年2 月休眠结束后才出现胚珠原基[18]；甜樱桃品种红灯在烟台、郑州和金华3 个地区花芽分化的起始和结束时间不同，但分化过程中形态特征的变化一致，均于休眠期之前发育出胚珠原基，并在休眠期间没有明显发育情况，这与该研究结果接近[19]。花芽在休眠期间虽然没有明显的结构变化，但其内部会发生大量的生化反应，以此调控花芽休眠期的开始与结束[20]。同时，不同年份和生理状态的植物的休眠期可能会有所不同，不能单单以时间判断进行采样[21]。

4 结论

通过对野生山樱桃的生长周期观察发现，山樱桃花芽分化过程由7 月初持续至10 月末，主要由花芽分化初期、花序原基分化期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期这6 个阶段组成。野生山樱桃花芽从7 月初进入分化初期，持续20 d 左右于7 月下旬进入花原基分化期，这一过程持续时间约为20 d，而后于8 月中旬进入花萼原基分化期，经过35 d 左右，于9 月下旬进入花瓣原基分化期，此后20 d 左右进入雄蕊原基分化期，经过15 d 左右进入雌蕊原基分化期，整个花芽分化过程于10 月末完成。

野生山樱桃群体于4 月初进入露瓣期，持续4 d左右，4 月中旬进入始花期，4 月末进入落花期，整个花期持续1 个月左右。单株花期持续约11～14 d，不同单株之间的物候期差异不明显。