腺苷酸激酶4在肺腺癌中的表达及其临床意义

田 华，何小勇，王道猛，杨永国，梅 霞，钱 斌

1.扬州市江都人民医院病理科，江苏 扬州 225200；2.扬州市江都人民医院胸外科，江苏 扬州 225200

肺癌是世界范围内病死率第一位的恶性肿瘤，而腺癌是肺癌最常见的组织学类型，约占所有肺癌的50%［1］。目前研究［2］表明，大多数肺腺癌是通过肺泡上皮非典型腺瘤样增生（atypital adenomatous hyperplasia，AAH）、原位腺癌（adenocarcinomain situ，AIS）、微浸润性腺癌（microinvasive adenocarcinoma，MIA）到浸润性腺癌（invasive adenocarcinoma，IA）这个癌变顺序发展而来，但其具体机制尚不明确。腺苷酸激酶4（adenylate kinase 4，AK4）是一种调节腺嘌呤核苷酸代谢和体内稳态的关键调节酶，研究发现AK4可促进肺癌细胞的转移，且其表达与肺癌患者预后差密切相关。然而，AK4在肺腺癌发生、发展过程中的作用还不十分清楚，本研究应用免疫组织化学方法研究AK4在肺腺癌发生过程中的不同阶段的表达，同时分析其与IA临床病理学特征之间的关系，旨在探讨AK4在肺腺癌发生、发展过程中的作用，为肺腺癌的早期诊断提供一个生物标志物，也为肺IA治疗提供一个潜在的分子靶点。

1 资料和方法

1.1 病例资料

收集江苏省扬州市江都人民医院2017年1月—2019年12月胸外科手术切除的297例肺腺癌不同阶段病变的标本，所有病例均经病理学检查确诊，其中IA 152例，MIA 52例，AIS 60例和AAH 33例。同时选取因肺部非肿瘤性病变进行肺手术切除的肺组织30例作为正常对照。

1.2 免疫组织化学方法

1.2.1 免疫组织化学试剂

鼠抗人AK4单克隆抗体购自美国LifeSpan Biosciences 公司，工作浓度为1 ∶150；EnVision法免疫组织化学试剂盒、抗原修复液、DAB显色试剂盒等购自美国Dako公司；H-E染色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组织化学方法

所有手术切除标本均采用4%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋成蜡块，然后使用切片机切片5 μm厚，分别进行H-E染色和免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用EnVision法，主要步骤如下：切片先放置于67 ℃烤箱中烘片2 h，然后脱蜡至水后用磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）冲洗3次，每次3 min；采用高压锅在高温高压下进行抗原修复，抗原修复液为枸橼酸钠缓冲液（pH为6.0），高压锅煮沸后继续加热2 min，然后自来水下自然冷却，冷却后取出玻片，先用蒸馏水冲洗2次，然后用PBS冲洗2次，每次3 min；切片滴加1滴3%H2O2，室温下温育10 min，以阻断内源性过氧化物酶活性，然后PBS冲洗3次，每次3 min；切片上滴加一抗，放置湿盒中，4 ℃冰箱中温育过夜；次日湿盒取出后置于室温下30 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加试剂A，室温下温育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加试剂B，室温下温育30 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加新鲜配制的DAB液，镜下控制反应时间，自来水终止染色；苏木精复染，0.1% HCl分化，自来水冲洗，蓝化，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，在显微镜下观察。

1.3 结果判断

所有免疫组织化学染色切片由病理科2名高年资主治医师在双盲条件下进行判读，结果不一致者在多头显微镜下共同阅片并达成一致。AK4阳性表达为颗粒状胞质阳性，结果判断参照参考文献［3］，先根据染色强度分为：无染色，0分；弱阳性，1+；中等阳性，2+；强阳性3+；然后根据阳性细胞百分比为25%进一步分为2组，AK4染色结果分为高表达和低表达，当阳性细胞染色强度为2+或3+且阳性细胞比例＞25%为高表达，其余则为低表达。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析。肺腺癌发生不同阶段病变中AK4表达的差异采用χ2检验，IA中AK4表达与临床病理学指标之间的关系采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺IA临床病理学特征

152例肺IA中，患者发病年龄52～73岁，平均62.6岁；男性90例，女性62例；肿瘤位于左肺66例，右肺86例；吸烟者55例，不吸烟者97例；肿瘤最大径为1.1～5.3 cm，其中≤3 cm者102例，＞3 cm者50例；肺腺癌组织学类型以主要结构作为该例主要组织学类型，腺泡型68例、贴壁型30例、微乳头型22例、实体型16例、乳头型16例；有淋巴血管侵犯者40例，无淋巴血管侵犯者112例；有胸膜侵犯者34例，无胸膜侵犯者118例；有淋巴结转移者53例，无淋巴结转移者99例；pTNM分期参照美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版进行分期，Ⅰ期92例，Ⅱ期60例。

2.2 AK4在肺腺癌不同阶段病变中的表达

AK4阳性表达为细胞质内颗粒状阳性（图1）。正常肺组织中，所有病例均无AK4表达。AK4在AAH、AIS、MIA和IA中的高表达率分别为63.6%、75.0%、71.1%和81.6%，均明显高于正常肺组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。AK4在AIS与AAH、AIS与MIA、MIA与IA之间的高表达率差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 AK4在肺腺癌发生不同阶段病变中的表达Tab.1 Expression of AK4 in different lesions of lung adenocarcinoma

图1 AK4在肺腺癌发生不同阶段病变中的表达Fig.1 Expression of AK4 at different stages of carcinogenesis in lung adenocarcinoma

2.3 肺腺癌中AK4表达与临床病理学特征之间的关系

AK4高表达与肺腺癌患者的年龄、部位、吸烟状态、肿瘤大小、脉管侵犯和胸膜侵犯无关（P＞0.05）。我们根据肺腺癌主要结构作为该例最终的组织学类型，结果显示，AK4在微乳头型、实体型肺腺癌中高表达率虽然高于腺泡型、贴壁型和乳头型腺癌，但差异无统计学意义（P＞0.05）。AK4在有淋巴结转移的肺腺癌中高表达率高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义（P＜0.05）；pTNM分期中，Ⅱ期肺腺癌中AK4高表达率高于Ⅰ期肺腺癌，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 AK4高表达与肺IA临床病理学特征之间的关系Tab.2 The correlation between high expression of AK4 and clinicopathological features in invasive adenocarcinoma of lung

3 讨 论

肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，近年来尽管包括外科手术、放疗、化疗、靶向治疗等多种治疗方法取得了很大进展，但肺癌患者的总体预后仍然很差，所有分期的5年生存率仅为15%，而且仅有16%的肺癌患者可在早期得到诊断［4］。因此，寻找肺癌发生、发展过程中的基因改变对于评估患者预后、提供肺癌早期诊断的生物标志物，以及提供肺癌治疗的靶点具有重要价值。

AK是多种生物活细胞中高能量磷酸化转移反应中的一类关键调节酶，在腺嘌呤核苷酸代谢和维持体内稳态中发挥重要作用［5］。目前在人体组织中发现了9种AK同工酶，它们共同调节不同细胞内的腺嘌呤核苷酸组成，以维持细胞的能量动态平衡［6］。不同AK在细胞内的定位不同，其中AK3和AK4表达于线粒体基质中，AK4与AK3具有高度的序列同源。但与AK3不同，AK4已被报道在体外无酶活性，但仍保留其核苷酸结合能力，生理上与线粒体ADP/ATP转运子相互作用，并作为一种应激反应蛋白维持细胞存活［7］。

AK4在恶性肿瘤中的作用近年来已有相关报道。郭嘉宁等［8］研究发现，前列腺癌中AK4阳性表达高于癌旁组织，且AK4异常表达与前列腺癌复发、远处转移和生存时间短密切相关。庞亮等［9］对肌肉浸润性膀胱癌AK4的研究发现，AK4在癌组织中高表达率显著高于癌旁正常组织，AK4高表达率与远处转移和脉管内瘤栓有关，生存分析显示，AK4高表达患者生存时间短于低表达者。李辰运等［10］研究发现，AK4在胰腺癌组织中的表达高于癌旁组织，AK4的异常表达与肿瘤分期、淋巴结转移、神经受侵犯、脉管内瘤栓相关，而且生存分析也提示AK4高表达患者生存时间短。Xin等［11］应用免疫组织化学和分子生物学方法研究发现，AK4高表达不仅与膀胱癌的肿瘤分期、远处转移和血管侵犯有关，还与膀胱癌患者不良预后相关，体外实验研究显示，AK4可促进膀胱癌细胞系的生长、侵袭和转移。Zhang等［12］研究发现，AK4可促进HER2阳性乳腺癌的进展。这些研究结果表明，AK4可以通过多种机制促进多种类型癌细胞的侵袭转移。

AK4与肺癌的相关研究目前国外较少，而国内尚未见相关报道。Jan等［13］首先采用微阵列数据库研究发现，AK4在肺腺癌中表达明显高于正常肺组织，肺癌中AK4高表达与肿瘤分期晚、疾病复发及预后差有关，进一步分析显示，AK4是通过下调ATF3从而促进肺癌细胞的侵袭转移。由于AK4的基因位于线粒体基质中，可能涉及到代谢相关的基因，Jan等［3］进行的另一项研究结果发现，HIF-1α活性在具有AK4代谢基因特征的肺癌中被显著激活，AK4过度表达使代谢向有氧糖酵解方向转变，增加细胞内活性氧水平，从而稳定HIF-1α蛋白水平，并以HIF-1α依赖性方式促进肺癌细胞的上皮-间质转化。他们通过分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中肺腺癌RNA序列数据发现，相比于其他AK的基因，AK4和AK1的基因高表达者肺腺癌患者的预后更差，采用shRNA降低AK4的表达可降低表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的基因突变细胞中EGFR的蛋白表达［14］。这些研究中虽然发现AK4在肺腺癌中高表达，但在肺腺癌发生过程中是早期还是晚期事件尚不清楚。我们应用免疫组织化学方法分析了肺腺癌发生不同阶段病变中AK4表达的变化，结果显示从AAH到IA中，AK4表达均明显高于正常肺组织，进一步分析显示，随着病变从AAH到腺癌进展，AK4表达率趋于增高，但它们之间差异无统计学意义。本研究结果提示AK4可能参与了早期肺腺癌的发生，提示AK4检测可以作为肺腺癌诊断的一个早期生物标志物。

本研究对AK4高表达与肺腺癌临床病理学特征之间的关系进行了分析，结果显示，AK4高表达与肺腺癌淋巴结转移和pTNM分期密切相关，淋巴结转移阳性及高pTNM分期者的肺腺癌中AK4表达率明显增高，本研究也进一步证实了AK4表达可以促进肺腺癌的侵袭转移。AK4高表达与患者年龄、性别、吸烟状态、肿瘤部位和脉管侵犯无关。本研究发现，肿瘤最大径＞3 cm和有胸膜侵犯者中AK4表达率高于肿瘤最大径≤3 cm和无胸膜侵犯者，但差异无统计学意义，可能与本组资料中＞3 cm和有胸膜侵犯的肺癌病例数少有关，尚有待于后期进一步积累病例研究。肺腺癌具有高度的异质性，同一肺腺癌可含有多种形态学结构，我们以肺腺癌主要结构进行AK4表达分析，结果发现，AK4表达率在实体型和微乳头型腺癌中高于其他类型的腺癌，但差异无统计学意义，需要进一步扩大样本量明确其意义。然而实体型和微乳头型已被明确为具有侵袭性的组织学结构，因此，AK4表达肺腺癌在临床生物学行为上可能具有高度侵袭能力，需要给予积极处理。

目前研究已经证实肺腺癌可存在多个驱动基因改变，AK4与这些驱动基因改变是否存在相关性还不清楚。由于本组病例中仅有少数病例进行了肺癌驱动基因的检测，我们未能进行这方面的相关分析，待以后肺癌驱动基因检测的病例数足够再进行深入的研究。

总之，AK4高表达在肺腺癌早期病变AAH中已经开始出现，提示AK4可能在肺腺癌的早期发生阶段发挥作用，AK4检测可以作为早期肺腺癌诊断的一种生物标志物。AK4高表达与肺腺癌的脉管侵犯、淋巴结转移和pTNM分期密切相关，通过肺腺癌AK4的检测可以更好地评估肺腺癌的恶性程度及预后。