无创假阴性2家系研究*

陈运春，黄盱宁，孔嫦瑛，胡建东

1.海南省海口市中医医院检验科，海南海口 570216；2.海南省海口市中医医院内科，海南海口 570216；3.海南医学院第二附属医院超声医学科，海南海口 570311；4.海南医学院第二附属医院妇产科，海南海口 570311

无创DNA产前检测技术(NIPT)通过采集孕妇静脉血来检测胎儿是否患3种常见胎儿染色体非整倍体异常：21-三体综合征(Down综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(Patau综合征)。先天性心脏病(CHD)是一种常见的先天畸形，是由原发性胚胎发育异常所致的心脏和胸腔内大血管结构异常，其发病率在活产新生儿中占0.5%～1.0%，在死胎中可高达3.0%[1]。本文对2例无创检查阴性伴CHD的先证者及父母进一步行细胞遗传学检查，进行观察性研究分析，探讨其成因及对策。

1 资料与方法

1.1一般资料 对2例无创检查阴性伴CHD的先证者及父母进一步行细胞遗传学检查，本研究经患者本人知情同意，未违反医学伦理学原则。

1.1.1病例1 先证者B超检查：中晚孕Ⅲ级产科(系统超声)，子宫增大，宫内见单胎，头位。胎儿测量参数，双顶径51 mm，头围185 mm，腹围174 mm，股骨长度36 mm，胎儿体质量估测(447±65)g。胎头椭圆形，颅骨环完整。颅内结构两侧对称，脑中线居中，脑室无增宽。小脑半球大小形态正常。颈项皮层厚约8 mm。胎儿上唇皮肤连续，双眼玻璃体，鼻可见。胎儿脊柱边缘连续。胎儿胸腔未见明显异常液区，心胸增大，以右心增大明显。心脏四腔心切面可显示，左右心腔不对称，三尖瓣均可见开放及关闭运动，二尖瓣未见开放、关闭运动。右室流出道切面可显示，左室流出道未显示，三血管切面仅见1条大动脉回声，胎心率138次/分，律齐。胎儿腹腔未见异常液性区。胃泡和膀胱可显示。双肾脏可显示，形态饱满，双肾回声弥漫性增强。胎儿上肢肱骨、尺骨及桡骨可显示；双手呈外翻状，姿势固定无变化，胎儿下肢股骨、胫骨及腓骨可显示。胎盘附着于子宫前壁，厚26 mm，成熟度0级，下缘覆盖宫颈口。脐带入口位于胎盘边缘。羊水最大深度 47 mm，透声好，脐动脉一条，未见脐带绕颈。脐动脉S/D=2.72。确诊CHD后于外院行引产术。

1.1.2病例2 先证者A型血，RhD阳性，RhC阳性，RhE阳性。乙型肝炎病毒血清学标志物5项检测：抗-HBc阳性，余阴性。丙型肝炎病毒阴性，人免疫缺陷病毒阴性，梅毒螺旋体抗体(TPPA)阴性。血常规正常。孕36+2周顺产出生，出生1 d住院诊断：CHD、房间隔缺损、室间隔缺损、隐睾、新生儿视网膜病变。查体：出生体质量1.8 kg，简易胎龄评分：足底纹理2分+乳头形成1分+指甲1分+皮肤组织2分+27分=33周。查血常规：白细胞计数12.14×109/L，血红蛋白175 g/L，血小板计数158×109/L。

彩色多普勒超声检查，超声测值：主动脉瓣环4 mm，主动脉窦部7 mm，升主动脉7 mm，肺动脉10 mm，降主动脉5 mm；左房前后径11 mm，室间隔3 mm，左室舒张末期14 mm，左室舒张末期14 mm，左室后壁5 mm，右室前后径8 mm。2D及M型特征：心房正位，心室右襻，房室连接及大血管连接关系正常，左心稍大，右心房腔内径正常；右室壁增厚约3 mm，室壁运动收缩幅度尚正常；室间隔主动脉瓣下回声中断约7 mm，房间隔中部回声中断约7 mm，各瓣膜形态结构正常，启闭尚可；降主动脉与肺动脉之间可见异常通道，宽约5 mm；心包腔内未见异常回声。彩色及频谱多普勒特征：瓣口流速M/S，二尖瓣1.0，三尖瓣0.9，主动脉1.1，肺动脉瓣1.8；房水平可见左向右为主的双向分流，室水平可见左向右为主的双向分流，流速均约1.0 m/s；降主动脉与肺动脉之间异常通道内似可见右向左蓝色血流，二尖瓣少量反流，三尖瓣少量反流，峰值流速约3.1 m/s；峰值压差约38 mm Hg，估测肺动脉收缩压约43 mm Hg；心内余瓣口未见异常彩色湍流信号。

1.2仪器与试剂 二氧化碳培养箱，北昂(BEION)染色体核型分析系统，张氏培养基，人体外周血淋巴细胞培养基(广州拜迪生物医药有限公司)、低渗液(0.075 mol/L的KCl溶液)、10 μg/mL的秋水仙素、固定液(甲醇、冰醋酸)、磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶、吉姆萨染液。

1.3方法 取肝素抗凝外周血1.5 mL，接种含30%小牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃经72 h培养，收获，G显带。羊水离心后取沉淀加张氏培养基5 mL混匀，接种25 cm2培养瓶，二氧化碳培养箱开放式培养，8～10 d收获，G显带。北昂(BEION)染色体核型分析系统计数30个分裂相，分析3～5个核型，视异常情况进一步加大计数100个分裂相、全基因组测序。核型描述参考人类细胞遗传学命名国际体制(ISCN2016)。

2 结 果

2.1病例1 先证者羊水染色体核型46，XY，der(8)t(6;8)(q23;p23)pat，1qh+pat。父母体健，非近亲结婚，无遗传病史，孕1产0。父母备孕前均未做染色体检查，遵孕期要求，做过无创产前DNA检测结果为阴性。父亲，男，33岁，表型正常，染色体核型:46，XY，t(6；8)(q23；p23)，1qh+，经《中国人类染色体异常核型数据库》鉴定专家组鉴定，查询《Cytogenetics Database》《中国人类染色体异常核型数据库》均未见相关报道，收录入《中国人类染色体异常核型数据库》，数据库编号：4058。母亲表型正常，染色体核型:46，XX。

2.2病例2 先证者染色体核型为46，XY，der(6)t(6；22)(p25；q11.2)pat。父母体健，非近亲结婚，无遗传病史，母亲孕期服药史不详，孕2产1。父母备孕前均未做染色体检查，遵孕期要求，做过无创产前DNA检测结果为阴性。患儿父亲染色体结果为46，XY，t(6；22)(p25；q11.2)，母亲染色体结果为46，XX。

先证者全基因组测序结果：未发现染色体非整倍体变异及与受检者临床表型相关的已知的、致病性明确的100 kb以上的微缺失/微重复变异。经过与临床诊断对照，患儿的心脏缺陷有可能与第6号染色体短臂部分(63810-251901)片段缺失有关，房间隔缺损有可能与第17号染色体长臂部分(34434626-34628911)片段重复有关，如果要明确诊断还需要做进一步的检测确诊。

2.32家系情况对比结果 见表1。

表1 2个家系情况对比表

3 讨 论

NIPT通过采集孕妇静脉血，利用新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA片段(包含胎儿游离DNA)进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，可以从中得到胎儿的遗传信息，从而检测胎儿是否患三大染色体病。无创DNA产前检测不是一个诊断性试验，导致不一致结果发生的主要原因是由于循环游离DNA(cfDNA)主要来自于胎盘绒毛的细胞滋养层细胞，后者并不总是能够代表胎儿情况，在真正的嵌合体(TFM)中，细胞滋养层细胞核型正常，而胎儿本身则为异常核型，胎儿胎盘嵌合是cfDNA检测结果与实际情况不符的主要生物学原因之一，这将导致NIPT假阴性结果。

CHD的发病机制不甚清楚，可能与染色体异常、基因突变、病毒感染及环境因素等有关。有研究认为，早期对先天性心脏畸形胎儿染色体异常作出诊断，对产前预测继续妊娠或下次妊娠的风险至关重要[2-4]。胎儿先天性心脏畸形以复杂畸形多见，合并心外畸形的发生率很高，染色体异常的发生率亦较高，且以18-三体综合征为主。多项研究认为，21-三体综合征可能是中国人群CHD胎儿染色体异常的常见类型[5-8]，而本文2例CHD病均伴以衍生染色体，临床少见，且衍生染色体均来自其父，由于其遗传物质的不平衡，而表现出较严重的临床症状，智力低下或伴多发畸形。

尽管胎儿超声检查的广泛应用可以获得相应的胎儿产前影像学资料，但这不是确诊的标准。由染色体异常引起的CHD约占5%，进一步进行遗传学检测及遗传咨询是必需的。张婧等[9]研究显示，WHO将预防措施分为三级预防:(1)一级预防，即孕前预防，针对导致CHD的原因及可能的危险因素，在孕前采取各种有效措施；(2)二级预防，提高产前诊断技术，选择性终止妊娠，减少CHD的发生(如病例1)；(3)三级预防，对出生后患儿的各种畸形进行积极、及早的治疗，提高生存质量(如病例2)。

通过对本文2家系的情况进行研究分析提示，临床工作中要注意掌握NIPT适应证，父母有染色体异常携带其本身是NIPT的不适用人群，不应该行NIPT，而应直接行核型的产前诊断。故建议要强调行婚前体检的染色体检查，及早检出染色体异常，对父母为染色体畸变核型携带者提前干预，可直接选择做第3代试管婴儿，选择性生育，避免缺陷患儿出生，避免家庭陷入巨大的精神和经济压力。