不同年份普洱生茶体外抗氧化活性与生化成分相关性分析

杨雪梅，赵建锐，刘莹亮，李家华*

（1.滇西应用技术大学普洱茶学院，云南普洱665000；2.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南昆明650201）

普洱生茶是在普洱茶地理标志规定范围内以云南大叶种茶鲜叶为原料，经杀青、揉捻、日光干燥、蒸压成型等工艺制成的紧压茶，其品质特征为：外形色泽墨绿、香气清纯持久、滋味浓厚回甘、汤色绿黄清亮，叶底肥厚黄绿[1]。大量研究证实普洱生茶具有多种保健功能，如降血脂、预防心血管疾病、抗癌抗突变、抗氧化、增强机体免疫力、改善动脉粥样硬化等[2-3]。普洱生茶与其它茶类相比，具有耐储存特点，且随着储存时间的推移，其主要生化成分发生转化而使其品质得到提高，从而使普洱生茶具备较高的品饮价值[4]。普洱生茶的储存年限是品质好坏的一个重要指标，也是普洱生茶研究领域的一个难点[5]。经过长时间的储存（10 年或者10 年以上），其滋味和香气可达最佳[6-7]。在自然储存过程中，生茶中内含成分含量会发生变化，此外，由于茶叶的自动氧化作用，导致生茶主要生化成分的变化趋势和熟茶的后发酵过程中成分变化走向较相似。

相关研究证实普洱茶具有显著的降脂减肥、抗脂质过氧化、抗衰老等生理功能[8-10]。近年来，随着对普洱茶生物活性以及功效研究的不断深入，世界各国已经认识到普洱茶的多重功效，其中抗氧化性是多种保健作用的基础。但是目前学者主要展开的研究是针对不同类型茶叶抗氧化功能的比较分析[11-13]。在普洱茶的研究领域中，主要开展的是对不同发酵程度普洱熟茶抗氧化活性的测定[14-16]。本文对不同储存年份的普洱生茶体外抗氧化活性与生化成分的相关性进行研究。旨在为普洱茶生产企业和普洱茶爱好者正确储存或收藏普洱茶提供数据支撑，为消费者合理、正确选择普洱茶产品提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶样：云南双江勐库茶叶有限责任公司，相同等级标准、相同存放地、不同储存年份（2006 年～2015 年）的普洱生茶标准样品为试验茶样，规格为357 g。

（+）-儿茶素[（+）-catechin，C]、表儿茶素[epicatechin，EC]、表没食子儿茶素[epigallocatechin，EGC]、表儿茶素没食子酸酯[epicatechin gallate，ECG]、表没食子儿茶素没食子酸酯[epigallocatechin gallate，EGCG]：维克奇生物科技有限公司；VC：德国DRE 公司；DPPH：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒、羟基自由基清除能力测试试剂盒：南京建成生物工程研究所。以上试剂均为分析纯。甲醇、乙腈（色谱纯）：美国安捷伦有限公司。

1.2 仪器与设备

X-5 紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；12C00 型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；HHS 型恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司；BS110 s 电子分析天平：德国Sartorius 仪器公司；ZMQS5001 型纯水仪：美国Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 不同年份普洱生茶水提物的制备

准确称取磨碎试样3 g；加450 mL 沸水，在沸水浴中浸提45 min，每一个样品设立3 个平行，每隔10 min摇瓶一次，过滤。洗涤残渣，滤液合并于500 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，备用。

1.3.2 水提物生化成分测定

茶多酚的测定方法：采用GB/T 8313—2002《茶茶多酚的测定》中的酒石酸亚铁比色法测定。

游离氨基酸的测定方法：采用GB/T 8314—2002《茶游离氨基酸总量测定》中的茚三酮比色法测定。

儿茶素、咖啡碱的测定方法：高效液相色谱法[17]。

含水量的测定方法：快速法[18]。

水浸出物的测定方法：采用GB/T 8305—2002《茶水浸出物测定》中的沸水萃取法测定。

1.3.3 体外抗氧化活性测定

将不同储存年份的普洱生茶水提物稀释为（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg 干茶/mL），待用。

称取0.1 g VC用超纯水溶于100 mL 容量瓶中，定容摇匀后稀释VC溶液到不同浓度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），待用。

1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力测定

取一定量（4.0 mg）的DPPH，用无水乙醇（100 mL）配制成0.04 mg/mL 的DPPH 溶液。分别取2 mL 不同浓度梯度的茶汤待测液，再加入2 mL 的DPPH 溶液混合均匀，暗反应15 min。用VC作为阳性对照，无水乙醇作空白对照，取上清液于517 nm 处测吸光值。DPPH自由基清除率/%=[1-（A样品-A空白）/A对照]×100

1.3.3.2 总抗氧化能力测定（T-AOC）

按照T-AOC 试剂盒加样表严格加样，以VC为阳性对照，取样量为1 mL。

总抗氧化能力/（U/mg）=[（测定OD 值-对照OD 值）÷0.01]÷30×（反应液总量÷取样量）÷待测样本浓度

1.3.3.3 羟基自由基清除率的测定

按照羟基自由基清除能力测试试剂盒加样表严格加样。以VC为阳性对照，取样量为0.2 mL。

羟基自由基清除能力/（U/mg）=[（对照管OD 值-测定OD 值）÷（标准管OD 值-空白管OD 值）]×标准样品浓度÷（待测样本浓度×取样量）

1.3.3.4 超氧阴离子自由基清除能力的测定

1）取5 mL Tris-HCl 加入0.5 mL 样本溶液，混合均匀后25 ℃下预热20 min；然后加入邻苯三酚0.5 mL，在25 ℃下继续保持4 min，加0.5 mL 浓盐酸终止反应。在325 nm 波长处测吸光值为Ai。

2）用0.5 mL 的去离子水代替1）中的0.5 mL 邻苯三酚，其余操作同上，测其吸光值为Aj。

3）空白管：用0.5 mL 去离子水代替1）中的0.5 mL样品溶液，吸光值为A0。

超氧阴离子自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）÷A0]×100

1.4 数据处理

数据均采用Excel 2016 和SPSS 64.0 软件进行处理；选择Duncan’s 检验在p＜0.05 检验水平上对数据进行显著性分析。选择Pearson 相关系数在p＜0.01 和p＜0.05 检验水平上对数据进行相关分析。所有数据均是3 次测试的平均值。

2 结果与分析

2.1 不同储存年份普洱生茶主要生化成分含量分析

不同储存年份普洱生茶主要生化成分含量见表1。

由表1 可知，供试样随着储存时间的增加含水量呈整体上增加的趋势，茶多酚、氨基酸均随储存时间的增加呈整体下降趋势。但供试样水浸出物、咖啡碱含量变化与储存年份的变化无规律可循。

不同储存年份普洱生茶儿茶素各组分含量见表2。由表2 可知，不同储存年份普洱生茶5 种主要儿茶素组分含量无变化规律。其中，EGCG 含量变幅为4.86%～7.12%，ECG 含量变幅为4.86%～6.34%，EGC 含量变幅为1.86%～2.98%，EC 含量变幅为1.22%～1.68%，C 含量变幅为0.58%～0.82%。与戚康标等研究结果相一致[19]。造成这一现象的原因可能是供试样在存放过程中，酯型儿茶素发生降解转化成为简单儿茶素，同时酯型儿茶素也会发生自动氧化，转化为其它物质，从而导致酯型儿茶素含量在儿茶素总量中的比例呈下降趋势。

表1 不同储存年份普洱生茶的主要生化成分含量Table 1 The contents of major biochemical components in nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years %

表2 不同储存年份普洱生茶儿茶素各组分含量比较Table 2 Determination of catechins in nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years %

2.2 不同储存年份普洱生茶体外抗氧化活性测定

2.2.1 DPPH 自由基的清除能力

研究以VC为阳性对照，测定了VC和不同储存年份普洱生茶在不同浓度下对DPPH 自由基的清除能力，回归方程和IC50值结果见表3。

表3 不同年份普洱生茶对DPPH 自由基的清除率Table 3 The clearance rate of DPPH radical of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years

从表3 可知，VC和不同储存年份的普洱生茶水提物对DPPH 自由基均表现出显著的清除效果，且量效呈线性关系，线性相关系数R2值均大于0.95。根据标准曲线可知，VC的IC50为0.135 mg/mL，10 个不同储存年份普洱生茶的IC50值范围为：0.515 mg/mL～1.243 mg/mL。即DPPH 自由基的清除能力强弱顺序为：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.2 超氧阴离子自由基的清除能力

图1 是10 个不同储存年份普洱生茶水提物为1.0 mg 干茶/mL 时对超氧阴离子自由基的清除率。

图1 相同浓度不同储存年份生茶对超氧阴离子自由基清除率Fig.1 The scavenging ratio of superoxidefree radical of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years in the same concentration

从图1 可知，不同储存年份的普洱生茶水提物为1.0 mg 干茶/mL 时，其对超氧阴离子自由基的清除率的变化范围是：17.01%～69.60%，且随储存时间的增加而降低。根据标准曲线可知，当VC清除率为17.01%和69.60%时，浓度分别为0.026 mg/mL 和0.23 mg/mL。即对超氧阴离子自由基的清除能力顺序为：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.3 羟基自由基的清除能力

图2 是10 个不同储存年份普洱生茶水提物为1.0 mg 干茶/mL 时对羟基自由基清除能力。

图2 相同浓度不同储存年份生茶对羟基自由基清除能力Fig.2 The scavenging activity of hydroxylfree radicals of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years in the same concentration

从图2 可知，不同储存年份的普洱生茶水提物为1.0 mg 干茶/mL 时，其对羟基自由基清除能力的变化范围是：39.41 U/mg～48.15 U/mg，且随储存时间的增加而降低。即对羟基自由基清除能力顺序为：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.4 总抗氧化能力

图3 是10 个不同储存年份普洱生茶水提物为1.0 mg 干茶/mL 时的总抗氧化能力。

从图3 可知，不同储存年份的普洱生茶水提物浓度为1.0 mg 干茶/mL 时，其总抗氧化能力的变化范围是：3.19 U/mg～7.88 U/mg，且随储存时间的增加而降低。即总抗氧化能力的强弱顺序为：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011 年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007 年生茶＞2006 年生茶。

图3 相同浓度不同储存年份生茶的总抗氧化能力Fig.3 The total antioxidant capacity of of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years

不同储存年份普洱生茶DPPH 自由基清除能力、超氧阴离子自由基的清除能力、羟基自由基清除能力、总抗氧化能力均随储存时间的延长而降低，其中超氧阴离子自由基的清除能力下降幅度最大，降幅达到75.61%；其次是总抗氧化能力，降幅达到59.52%。这与赵熙等研究结果相一致[20]。

2.3 体外抗氧化活性与生化成分的相关性分析

表4 是普洱生茶的体外抗氧化活性与对应生化成分的相关性分析。

表4 体外抗氧化活性与生化成分的相关性分析Table 4 Correlation analysis of antioxidant activity and biochemical components in vitro

从表4 中可以看出，普洱生茶的体外抗氧化活性和生化成分都呈现正相关。其中抗氧化活性与茶多酚和氨基酸有极显著相关性（p＜0.01），与儿茶素总量有显著相关性（p＜0.05），其次是咖啡碱和水浸出物。这与马慧等研究结果相一致[21]。其原因可能是：随着储存时间的增加，普洱生茶在多酚氧化酶的作用下，儿茶素类会发生氧化反应和氧化偶联反应等生成了邻苯酚醌及邻醌类物质。在此过程中，多酚羟基的数量会减少，所以抗氧化能力也就相应降低。氨基酸具有一定的抗氧化活性，但是相比于一些酚类、黄酮类、维生素类强抗氧化剂，氨基酸的抗氧化活性相对较小。由于氨基酸和其它抗氧化剂的还原电位不同决定了二者之间发生修复再生作用，即协同抗氧化能力，所以，氨基酸发挥其抗氧化活性的作用机理之一便是与其它抗氧化剂发挥协同抗氧化的作用[22]。随着储存时间的增加，氨基酸会发生降解，也会与多酚类反应生成了不同分子量的聚合物，所以氨基酸含量会降低，导致抗氧化能力也就相应降低。咖啡碱化学性质不活泼，是一种嘌呤碱杂环化合物，难以参与氧化降解反应，但咖啡碱和多酚类会因修复再生的关系发挥协同抗氧化的作用[23]。茶叶水浸出物中含有多酚类（包括水溶性色素）、游离氨基酸、咖啡碱、可溶性糖、水溶维生素、水溶果胶、水溶蛋白、无机盐等，因而茶叶中的水溶性成分抗氧化性有一定的复杂性[23]。

3 结论

本试验将茶叶水提物与VC的抗氧化能力进行比较，结果发现普洱生茶水提物有较高的体外抗氧化活性。且体外抗氧化活性和生化成分都呈现正相关性，其中与茶多酚和氨基酸含量呈极显著正相关，表明茶叶中茶多酚具有良好的抗氧化性能，为茶多酚作为抗氧化剂应用到食品加工中提供了一定的依据。