研磨对豌豆分离蛋白应用特性的影响

刘巧珍，代养勇*，侯汉学，王文涛，丁秀臻，张慧，董海洲

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018；2.山东省粮食加工技术工程技术研究中心，山东泰安271018）

目前很多研究表明：过多摄入动物蛋白会增加冠心病等的患病概率，导致低脂、低热量的植物源蛋白的需求增大[1-2]。目前我国豌豆加工的重点是制备豌豆淀粉，豌豆蛋白为其副产品[3]。由于豌豆蛋白在加工过程中易变性，持水性差，起泡性和乳化性也不太理想，导致豌豆蛋白研究与开发不足，随之绝大部分豌豆蛋白作为饲料，造成了蛋白质资源的极大浪费[4-5]。因此，需要改善豌豆蛋白的应用特性，扩大其在食品工业的应用。

目前，蛋白性质主要是通过物理法、化学法和酶法等方法来改善[6]。其中，物理法简单、环保，且安全性高。研磨作为一种有效的物理改性手段，可以制备一些新材料。研磨通过机械力（摩擦、撞击等）克服颗粒的内聚力，使物料破碎；同时，研磨过程中产生的反复高能量冲击造成机械力化学效应，会引起物料性质的变化[7-8]。在食品加工领域，学者多数采用湿法来改善蛋白性质。吴迪等[9]采用高压均质改善栉孔扇贝蛋白乳化特性。孙靖辰等[10]则利用超声提高米糠蛋白的溶解度、凝胶性等功能特性。关于干法改善蛋白性质的报道很少，干法处理后无需干燥、能耗低，比湿法处理更易在工业中推广。

本文采用研磨技术干法处理豌豆分离蛋白，研究研磨后豌豆分离蛋白颗粒形态结构、亲水基团、疏水基团、持水性、持油性、泡沫特性、乳化性能、凝胶性能等结构与应用特性的变化，并通过分析亲水（油）性与应用特性的相关性，探讨研磨对豌豆分离蛋白颗粒的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

豌豆分离蛋白：双塔食品有限公司；尼罗红：阿拉丁工业公司；一级大豆油：市售；溴化钾（KBr）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：西格玛化学公司；所用化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

ST-Q200 行星式球磨机：北京旭鑫仪器设备有限公司；JSM-6510LV10800 钨灯丝扫描电子显微镜：日本JEOL 公司；JC2000C1 型接触角测量仪：上海中晨数字技术设备有限公司；TG1650-WS 台式高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；UV-8000A 紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；TA.XTC 质构仪：上海保圣实业发展有限公司；T18 digital Ultra-T高速分散器：德国IKA 公司。

1.3 豌豆蛋白研磨处理

用研磨机研磨豌豆分离蛋白。其中球与样品质量比为5∶1。机器在室温25 ℃下，以200 r/min 的转速运行。其中每隔2.5 min 停止仪器运行1 h，并将研磨罐水浴冷却，以减少研磨过程中热量的产生。研磨结束后样品放入自封袋中，4 ℃保存。

1.4 扫描电镜

使用离子喷射器在样品表面镀一层15 nm 左右的金箔后（豌豆蛋白样品经过离子溅射仪喷金后），在工作距离5.1 mm，加速电压6 kV，放大倍数1 000 条件下通过扫描电镜进行观察并拍摄[11]。

1.5 接触角的测定

取适量豌豆蛋白样品用压片机压成光滑的薄片，选用去离子水、大豆油作为润湿性试验液体，通过接触角测定仪采用悬滴法依次测定液滴与样品表面的接触角。

1.6 应用特性的测定

1.6.1 持水性的测定

持水性根据耿军凤等的方法[12]，略有改动。准确称取0.1 g 豌豆蛋白样品置于离心管内后加入20 mL 蒸馏水，用玻璃棒将其搅均，随后在80 ℃水浴中保温60 min，取出冷却。将冷却至室温（25℃）的样品于3 000 r/min 下离心30 min，倒去上清液。测定此刻离心管加沉淀物的质量。持水性计算公式如下。

式中：W0为豌豆蛋白质量，g；W1为豌豆分离蛋白加离心管质量，g；W2为离心后离心管加沉淀物质量，g。

1.6.2 持油性的测定

准确称取2.0 g 豌豆蛋白样品置于离心管内加入10 mL 大豆油，用玻璃棒将其搅均，静置30 min 后于3 000 r/min 离心30 min，倒去上清液。测定离心管与沉淀物的质量。持油性计算公式如下[13]。

式中：W0为豌豆蛋白质量，g；W1为豌豆分离蛋白加离心管质量，g；W2为离心后离心管加沉淀物质量，g。

1.6.3 起泡性和泡沫稳定性的测定

配制3%的豌豆蛋白质溶液，用氢氧化钠或者盐酸调节样品pH 值至7.0，在30 ℃水浴下保温10 min，然后用高速分散器在5 000 r/min 下均质3 min 后迅速倒入量筒中。记录均质前溶液的体积，均质结束时泡沫的体积，均质结束10 min 的泡沫体积。起泡性（foaming characteristic，FC）和泡沫稳定性（foaming stability，FS）[14]计算公式如下。

式中：V 为均质前溶液的体积，mL；V0为均质结束时泡沫的体积，mL；V1为均质结束10 min 的泡沫体积，mL。

1.6.4 乳化性和乳化稳定性的测定

采用比浊法测定乳化特性。配制1 mg/mL 的待测样品以9∶1 的质量比加入大豆油，经高速分散器于10 000r/min 下均质2min，分别在搅拌后0min 和10min时从测试管底部取样100 μL，用质量浓度为0.1 g/L 的SDS 稀释50 倍后，测定样品在500 nm 处的吸光度值，以SDS 溶液做空白[15]。乳化性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）的计算公式如下。

式中：DF 为稀释倍数；C 为样品浓度，g/mL；φ 为光程，φ=1 cm；θ 为乳液中油相所占比例；A0为0 min时测定的吸光度；A10为10 min 时测定的吸光度；t 为时间，t=10 min。

1.6.5 凝胶性的测定

将配制17%豌豆蛋白溶液放入磁力搅拌器中以1 500 r/min 搅拌60 min，随后在90 ℃下水浴保温30 min。取出冷却在4 ℃冷藏过夜，制得豌豆蛋白凝胶[16]。在质构仪上测定其质构特性[17]。

1.7 数据分析

所有试验均重复3 次，采用Origin 软件进行图表绘制。采用SPSS 软件对数据进行ANOVA 差异显著性分析，以P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质显微结构的影响

豌豆蛋白的扫描电镜图见图1。

图1 豌豆蛋白的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrograph of pea protein

由图1 中可见，研磨处理后的豌豆分离蛋白形貌特征发生了明显变化。豌豆分离蛋白原样完整，表面平滑，粒径较大，且分布比较集中，与XIONG 等[18]研究一致。当研磨2.5 min～7.5 min 时，部分豌豆分离蛋白破碎，颗粒粒径开始变小，表面开始变得不平滑，部分颗粒表面黏附有碎片形成了聚集体（图1 D）。随着研磨时间的增加，蛋白质的结构严重破坏，颗粒粒径明显变小，颗粒碎片呈现出不规则、无序的形态，颗粒表面显著粗糙、质地也明显疏松。对蛋白的破坏越严重，碎片呈现出各种不规则、无序的形态，颗粒表面变粗糙，质地变得疏松。

2.2 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质接触角的影响

豌豆蛋白片表面的水接触角光学照片见图2，豌豆蛋白片表面的油接触角光学照片见图3。

蛋白质的亲水性是指蛋白对水的亲和能力，表面被水所润湿的能力[19]。蛋白质的亲/疏水性、润湿性，对蛋白质的应用特性有重要的指导意义。本文通过去离子水、大豆油在豌豆蛋白表面形成的接触角来表征亲/疏水性、润湿性。

图2 豌豆蛋白片表面的水接触角光学照片Fig.2 Optical photo of water contact angle on the surface of pea protein sheet

图3 豌豆蛋白片表面的油接触角光学照片Fig.3 Optical photo of oil contact angle on the surface of pea protein sheet

结合图2、图3 可看出，研磨后蛋白质的亲水性增强，亲油性降低。随着研磨时间的延长，蛋白质的亲水性呈现出现先升高后降低的趋势。在研磨时间为7.5 min 时，蛋白质的亲水性达到最大。这主要是由于短时间地研磨下，蛋白发生了团聚、折叠现象（图1 D），减少了蛋白颗粒表面和间隙中的空气含量，同时蛋白质内部的部分极性基团暴露出来，导致亲水性得到了提高[20]。而当研磨时间过长时，颗粒结构严重破坏（图1G），蛋白质结构中大量疏水基团暴露，同时蛋白粒径的降低使得空气容易在蛋白质的表面形成气膜，这导致了水对蛋白质的润湿性减弱，所以这时蛋白亲水性减弱[21]。

2.3 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质持水性的影响

研磨时间对豌豆蛋白持水性的影响见图4。

图4 研磨时间对豌豆蛋白持水性的影响Fig.4 The effect of grinding time on the water retention of pea protein

持水性是将水截留在组织内的能力[22]。由图4 可知，研磨处理时间在2.5 min～7.5 min 时，蛋白质的持水性随着研磨处理时间的延长而增大。研磨处理7.5 min时，豌豆分离蛋白的持水性达到最大为4.095 g/g，比原样升高了37.4%。这可能是因为，短时间的研磨处理使蛋白分子伸展，极性基团暴露于表面，亲水性增加，水分子能够稳定的存在于蛋白结构中[23]。但是研磨超过7.5 min 时持水性降低，这是由于长时间研磨导致蛋白质结构严重破坏，降低了蛋白质与水结合的有效性，导致蛋白质的持水性下降。

2.4 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质持油性的影响

研磨时间对豌豆蛋白持油性的影响见图5。

图5 研磨时间对豌豆蛋白持油性的影响Fig.5 The effect of grinding time on the oil retention of pea protein

持油性是指对油吸附并将油截留在组织内部的能力[24]。由图5 可知，随着研磨时间的延长，豌豆分离蛋白的持油性呈现先升高后降低的趋势，在研磨时间为7.5 min 时，蛋白质的持油性达到最大。这可能是因为短时间研磨，蛋白质极性基团暴露导致部分疏水基团内埋，虽然亲油性下降，但油滴可以稳定的存在于疏水基团的空隙中[25]。随后蛋白质结构遭到严重破坏，与油结合的紧密性下降，持油性降低[26]。

2.5 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质起泡特性的影响

良好的起泡特性可满足食品加工的特殊需要，如蛋糕、啤酒等的加工。起泡性指在搅打的过程中，形成气泡的能力[27]。起泡稳定性则指泡沫不被破损的能力[28]。研磨时间对豌豆蛋白溶液起泡性（FC）及起泡稳定性（FS）的变化影响如图6 所示。

图6 研磨时间对豌豆蛋白起泡特性的影响Fig.6 The effect of grinding time on the foaming characteristics of pea protein

由图6 可知，随着研磨时间的增大，豌豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性均呈现先增加后减小的趋势，其中研磨时间为7.5 min 时，豌豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性均达到最大。原因是此时间内蛋白分子发生适度伸展，蛋白分子间能形成比较稳定的网络结构和界面膜，同时蛋白质与水相互作用增强，使得蛋白的起泡性不断增加[29]。当研磨时间大于7.5 min 时，豌豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性开始下降，这是由于豌豆蛋白变性严重，蛋白质分子间相互作用减弱；同时大量疏水基团的暴露使蛋白质亲水、持水性下降，产生的泡沫界面膜缺乏韧性容易破裂，导致豌豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性开始下降[30]。

2.6 研磨处理时间对豌豆分离蛋白乳化性能的影响

研磨时间对豌豆蛋白乳化性能的影响见图7。

图7 研磨时间对豌豆蛋白乳化性能的影响Fig.7 The effect of grinding time on the emulsification of pea protein

乳化性能是蛋白质重要的功能特性之一。乳化性（EAI）表示蛋白乳液的形成能力，乳化稳定性（ESI）是蛋白乳液保持稳定的能力[31-32]。由图7 可见，研磨处理能显著提高豌豆分离蛋白的乳化性能，其中研磨时间为7.5 min 时具有最好的乳化性能，EAI 和ESI 达到17.14 m2/g 和122.33 min，分别比原样提高了79.10%和49.42%。结果表明：适当的研磨处理会使蛋白质的空间结构适当分散，蛋白质分子适度伸展，部分内埋的极性基团和非极性基团暴露，蛋白质在油水界面更易吸附，蛋白质吸附到油-水分界处的速率得到提高，因此提高了豌豆分离蛋白的乳化性及乳化稳定性[33]。但长时间研磨后，蛋白质维持稳定空间结构的键遭到破坏，蛋白质发生严重变性，降低了蛋白质膜与油水界面的吸附力，使豌豆分离蛋白的乳化性和乳化稳定性下降[34]。在食品加工过程中，常常会出现乳化性不理想的问题，因此经过研磨处理的豌豆分离蛋白在食品行业中有较大的优势。

2.7 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质凝胶性能的影响

研磨时间对豌豆蛋白凝胶性能的影响见表1。

表1 研磨时间对豌豆蛋白凝胶性能的影响Table 1 Effect of grinding time on pea protein gel properties

受到外力作用变形除去作用力时，能恢复原来形状的性质为弹性，在一定时间内的回复能力为回复性[35]。

由表1 可知，豌豆分离蛋白凝胶的弹性、回复性表现出相同的趋势。随着研磨时间延长，凝胶的弹性、回复性先增大后减小。研磨时间为7.5 min 时，凝胶的弹性、回复性达到最大。出现这种趋势的原因是研磨时间的增大，使得蛋白质分子伸展，内埋基团暴露，蛋白质-蛋白质相互作用增加，促进形成凝胶网状结构，弹性增大，回复性增大[36]。当研磨时间进一步延长时，蛋白质结构被破坏，随之维持稳定凝胶网状结构的键被破坏，因此弹性、回复性降低。

2.8 相关性分析

亲水性、亲油性与蛋白应用特性相关性分析见表2。

表2 亲水性、亲油性与蛋白应用特性相关性分析Table 2 Correlation analysis of hydrophilicity，lipophilicity and protein application characteristics

相关性分析表明，亲水性对豌豆分离蛋白的应用特性影响趋势一致，呈正相关，其中持水性、持油性、乳化特性、凝胶弹性表现出极显著正相关。亲水性对豌豆分离蛋白应用特性的影响表现为亲水性越高，应用特性越好。亲油性对豌豆分离蛋白的应用特性影响趋势一致，呈负相关，其中乳化性表现出极显著负相关，持油性表现出了显著负相关。表明亲油性对豌豆分离蛋白应用特性的影响表现为亲油性越好，应用特性越差。

3 结论

研磨显著提高了豌豆分离蛋白的亲水性、持水性、持油性、起泡性和泡沫稳定性等应用特性；且乳化性能、凝胶性能也得到不同程度的提高。其中研磨7.5 min 时豌豆分离蛋白应用特性最佳。这些发现将有助于豌豆蛋白稳定乳液产品的研发。

在研磨作用下，豌豆蛋白的颗粒出现了聚集、团聚等类似机械力化学效应的现象。今后可将研磨与低剂量变性剂结合共同改性蛋白，提高其应用特性，开发更多的高性能豌豆分离蛋白产品。