马齿苋多糖对反流性食管炎模型大鼠的保护作用及其机制研究

何 灵，史 文，代红燕，白 杰

（新疆医科大学1研究生院，2第一临床医学院临床本硕2016-2班，3基础医学院机能实验中心，4药学院药理教研室，乌鲁木齐830011）

反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)是胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)的一种，属于胃肠动力功能障碍性疾病[1]。它是由胃、十二指肠内容物反流入食管引起的食管炎性病变，临床表现为胸骨后灼痛、反酸嗳气、灼热烧心等症状[2]。内镜下可见食管黏膜糜烂、溃疡。RE发病原因和机制尚不清楚，可因精神压力、饮食、生活不规律引起，涉及神经免疫调节、脑-肠轴调节及肠道菌群改变。此外各种胃肠激素如Ghrelin、血管活性肠肽(VIP)和白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子也参与了胃肠动力不足的病理生理机制[3]。马齿苋（Portulaca oleracea L）为马齿苋科植物马齿苋的干燥地上部分，是一种药食同源植物。性酸、寒，利大小肠，具有清热利湿、解毒消肿、凉血止血功效[4]。现代研究表明其化学成分包括生物碱类、黄酮类、多糖类等多种生物活性物质[5]。马齿苋多糖经分离纯化，可得到POL Ib、POL IIa和POL III3种多糖。已有研究发现，7月采收于河南的马齿苋，采用溶剂提取法提取的马齿苋多糖含量可高达26.8%[6]。马齿苋多糖具有调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗炎、促愈合等多种药理活性，但马齿苋多糖对RE模型大鼠是否有保护作用尚不清楚。本实验采用低剂量（7.5 g/kg）、中剂量（15 g/kg）和高剂量（30 g/kg）马齿苋多糖，采用刺激法+导尿管球囊扩张法建立RE模型，观察大鼠胃排空功能，离体幽门括约肌收缩功能，以及血清VIP、Ghrelin、胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)水平和食管组织匀浆炎症因子的影响，探讨马齿苋多糖对RE模型大鼠的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠，体重180~200 g，雌雄各半。均由新疆医科大学动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK（新）2016-0003，使用许可证：SYXK（新）2016-0002。

1.2 药物与试剂马齿苋药材（购自新疆百草堂大药房，批号20181021），附子理中丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号20180418），VIP、Ghrelin、MTL、GAS试剂盒（北京诚林生物科技有限公司），IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ试剂盒（上海钰博生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 马齿苋多糖的制备 称取干燥马齿苋药材600 g，蒸馏水冲洗3次，粉碎，各用10倍量、8倍量及6倍量水煎提取1 h过滤，合并3次滤液，置旋转蒸发仪浓缩至600 mL，浓缩液以乙醇调至浓度75 %，搅拌，4℃静置24 h，沉淀物分别以无水乙醇、丙酮回流洗涤，得灰白色多糖粉末，低温冷冻干燥，置4℃密封保存，临用时用蒸馏水配制成所需浓度。

1.3.2 刺激法+导尿管球囊扩张法建立RE模型 SD大鼠72只，雌雄各半，分层随机分成6组，每组12只。对照组（生理盐水），模型组，马齿苋高、中、低剂量组和附子理中丸组。除对照组外，其余各组大鼠采用夹尾刺激法+导尿管球囊扩张法建立反流性食管炎动物模型。将大鼠置于笼中，用止血钳夹住大鼠尾巴中1/3处，使之激怒并相互厮咬，每次夹尾40 min，每隔20 min更换一次夹尾的位置，每日1次，连续刺激7 d。使之出现胃排空功能障碍[7]。在第7天夹尾刺激后腹腔注射10 %戊巴比妥钠(50 mg/kg)全身麻醉。打开腹腔暴露并游离食管下段及贲门处，在食管后方放置2条橡皮筋，标记食管下括约肌(LES)的近端及远端，向导尿管气囊内注入5 mL气体后，向外拉出气囊直至拉不出为止，此时气囊位于胃食管交界处。吸出气囊气体后，向食管内拉入2～3 cm，使气囊位于LES处，注入5～8 mL气体，使LES充分扩张，并把橡皮筋从食管后方牵拉食管以固定扩张的球囊，维持5 min，重复2次，每次间隔3 min，造成食管下括约肌松弛[8]。

1.3.3 药物干预 对照组、模型组大鼠给予相同体积的生理盐水，附子理中丸组按临床剂量70 kg，9 g/d折算成大鼠0.8 g/kg，马齿苋高剂量组以30 g/kg，中剂量组以15 g/kg，低剂量组以7.5 g/kg，每天1次，连续灌胃10 d。

1.3.4 马齿苋多糖对大鼠胃排空功能的影响

1.3.4.1 营养性半固体糊的制备 取羧甲基纤维素2.5 g，溶于62.5 mL蒸馏水中，分别加入奶粉4 g，白砂糖2 g，淀粉2 g，搅拌均匀，配制成营养性半固体糊。4℃保存备用，用时2 h取出恢复至室温[9]。

1.3.4.2 取材 各组大鼠于末次给药后禁食12 h（自由饮水），第10天再次给药，15 min后灌胃营养性半固体糊（0.02 mg/g）。20 min后处死大鼠，沿腹中线切开，暴露大鼠全胃，分别结扎贲门、幽门，摘取全胃，用滤纸拭干血迹后称胃全重，沿胃大弯侧剪开胃腔，观察胃残留食物情况，洗去胃内容物，滤纸吸干，称胃净重。计算胃排空率（%）=[1-(胃全重-胃净重)/所灌营养性半固体糊量]×100 %。以胃排空率为指标评价胃排空功能。

1.3.5 马齿苋多糖对离体幽门括约肌收缩功能的影响 取大鼠幽门括约肌标本，在其两端对角处各扎一线，一端固定在容量为25 mL的浴槽内，另一端与肌张力换能器相连。浴槽内盛恒温(37±0.5)℃Kreb’s液，供95 % O2±5 % CO2混合气，标本静息负荷1 g，平衡30 min后，用BL-420生物机能信号采集与分析系统记录给药前、后幽门括约肌的自发收缩活动。先描记5 min正常收缩曲线，向浴槽中依次滴加低、中、高剂量马齿苋多糖各100µL，记录给药后5 min括约肌收缩曲线。每种药物完成后，立即用新鲜恒温台式液冲洗3次，待收缩恢复正常后再进行下一次给药，无法恢复正常收缩的括约肌弃去。

1.3.6 马齿苋多糖对大鼠血清胃肠激素水平的影响各组大鼠眶静脉取血3 mL，离心取血清，用酶联免疫吸附法按照试剂盒说明书测定血清VIP、Ghrelin、GAS和MTL的含量。

1.3.7 马齿苋多糖对大鼠食管组织匀浆细胞因子的影响 取大鼠食管冻存组织2 g左右，加生理盐水用匀浆机进行2 000 r/min、20 min匀浆，低温3 000 r/min、20 min离心，取上清分装冻存于-20℃冰箱。按试剂盒要求检测食管组织中IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量。

1.4 统计学处理数据分析采用SPSS22.0软件，计量资料用均数±标准差（-x±s）表示。多组间样本比较采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐时采用LSD法进行两两比较，方差不齐时两两比较采用T2方法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 马齿苋多糖对RE模型大鼠胃排空率的影响对照组、模型组、马齿苋低剂量组、马齿苋中剂量组、马齿苋高剂量组、附子理中丸组胃排空率分别为(0.708 5±0.033 0)%、(0.354 3±0.041 3)%、(0.403 2±0.120 0)%、(0.530 6±0.036 8)%、(0.067 6±0.073 4)%、(0.605 8±0.041 7)%。与对照组相比，模型组胃排空率明显下降；与模型组相比，马齿苋多糖中、高剂量组胃排空率增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 不同浓度马齿苋多糖对大鼠离体幽门括约肌自发收缩曲线的影响在恒温Kreb’s液条件下，幽门括约肌舒缩频率、幅度、张力、时间及间隔均较稳定，收缩波形无明显变化，表现为具有自发性收缩、紧张性等生理特性，见图1A。曲线稳定后立即滴加马齿苋多糖，曲线振幅明显减小，明显抑制幽门括约肌收缩，结果见图1B、1C、1D。

图1 不同浓度马齿苋多糖对大鼠离体幽门括约肌自发收缩曲线的影响

2.3 不同浓度马齿苋多糖对大鼠离体幽门括约肌自发收缩曲线平均振幅的影响将不同浓度的马齿苋多糖分别加入浴槽内，幽门括约肌的收缩波平均振幅明显降低，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中，30 g/kg的马齿苋多糖对幽门括约肌收缩活动效果最为显著，撤除药物后，观察8~10 min，幽门括约肌收缩活动全部恢复至正常水平。见表1。

2.4 马齿苋多糖对RE模型大鼠血清胃肠激素水平的影响与对照组比较，模型组大鼠血清VIP含量升高（P＜0.01），而Ghrelin、GAS及MTL含量下降（P＜0.01）；与模型组比较，马齿苋多糖中、高剂量组明显升高了大鼠血清Ghrelin、GAS及MTL水平（P＜0.05）。VIP含量下降（P＜0.01），差异有统计学意义，见表2。

表1 不同浓度马齿苋多糖对幽门括约肌收缩曲线平均振幅的影响（-x±s）

表2 不同剂量马齿苋多糖对RE模型大鼠血清胃肠激素的影响（-x±s，n=12）

2.5 马齿苋多糖对RE模型大鼠食管组织细胞因子水平的影响与对照组比较，模型组大鼠食管组织匀浆IL-1β、Il-6、TNF-ɑ及IFN-γ水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，马齿苋多糖低、中、高剂量组食管组织IL-1β、IL-6、TNF-ɑ及IFN-γ含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同剂量马齿苋多糖对RE模型大鼠食管组织细胞因子的影响（±s，n=12）

表3 不同剂量马齿苋多糖对RE模型大鼠食管组织细胞因子的影响（±s，n=12）

注：与对照组比较，*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

组别对照组模型组低浓度马齿苋多糖中浓度马齿苋多糖高浓度马齿苋多糖附子理中丸组IFN-γ/(µg/L）164.65±20.52 205.63±18.81**194.37±19.21 172.63±20.68#158.35±21.25##161.59±23.64##剂量/（g/kg）等体积生理盐水等体积生理盐水7.5 15.0 30.0 0.8 IL-1β/(µg/L）4.26±1.41 6.24±0.59*5.42±1.25 4.78±0.93#3.91±1.47##4.48±1.36##IL-6/(µg/L）74.14±12.25 93.54±10.17**90.37±11.48 81.25±10.61#76.49±11.54##78.51±13.02##TNF-ɑ/(µg/L）96.46±6.18 108.77±7.57**104.54±5.27 98.15±6.55#94.51±5.17##96.85±6.66##

3 讨论

胃排空能力受胃内容物成分及生理状态的影响。目前，多采用含10%明胶的酚红溶液灌胃，以胃酚红排空率为指标的方法。本实验采用营养性半固体糊灌胃大鼠，营养结构接近日常食物，较非营养食料（如酚红溶液）符合生理状况，可避免比色法测定时药物本身颜色对测定结果的影响。因此，本法更能准确反映马齿苋多糖对大鼠胃排空功能的影响。本实验结果显示，马齿苋多糖低、中、高剂量组呈剂量依赖性地提高了RE模型大鼠胃排空率。

RE是由于食道下段、贲门及幽门括约肌收缩舒张功能不协调，属胃肠动力障碍性疾病。多种胃肠激素和细胞因子参与了RE的发生发展，可代表RE的发展程度。本实验采用夹尾刺激法+导尿管球囊扩张法建立RE动物模型，模拟了人体精神压力导致植物神经功能紊乱，括约肌收缩舒张功能不协调的特点，同时气囊扩张物理性地造成食管下括约肌松弛，避免了手术对平滑肌纤维器质性的损伤，大鼠存活率高。本实验结果表明，该模型大鼠出现胃排空率下降，食管黏膜充血水肿，大鼠血清VIP水平升高，Ghrelin、MTL和GAS水平下降，食管组织匀浆IL-6、IL-8、TNF-α及IFN-γ含量升高，表明模型建立成功。

食管下段括约肌受非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经支配，NANC神经受抑制后引起食管下段括约肌松弛，导致RE发生[10]。VIP是NANC神经的主要抑制性神经递质，能抑制人体的胃肠运动并阻碍胃排空，介导食管下段括约肌松弛。由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生的高浓度一氧化氮（NO），与炎症的发生密不可分，可能与食管黏膜损伤相关，参与食管炎症的发生发展。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）介导的NO是引起食道下段括约肌舒张的直接原因。另外NO的释放还能刺激VIP的产生，进一步加重RE症状。已有研究发现厚朴木兰（MsHE）己烷提取物通过降低脂多糖刺激的巨噬细胞上NO的产生以及iNOS的表达水平，改善RE症状达到治疗效果[11]。本研究发现马齿苋多糖呈剂量依赖性地降低了RE大鼠血清VIP水平，可能是其提高胃排空率的原因之一。今后将进一步研究VIP对食管下段括约肌功能、食管iNOS和eNOS表达及组织NO含量的影响。

与VIP相反，Ghrelin、MTL和GAS都是兴奋性胃肠激素，有促进胃排空作用，与消化道动力密切相关。动物实验表明，Ghrelin通过激活中枢和肠神经元，通过激活中枢生长激素促分泌素受体和中枢神经肽Y途径以及周围毒蕈碱型乙酰胆碱受体来积极调节胃肠蠕动，从而促进胃排空。Ghrelin信号受损可能导致GERD大鼠胃肠动力异常[12]。已有研究发现，RE患者胃黏膜Ghrelin表达和血清Ghrelin水平均下降，导致胃排空延迟，近端胃扩张，进一步诱发食管下段括约肌松弛，最终导致胃食管反流发生[13]。MTL参与了消化间期移行性运动复合波Ⅲ相(MMC III)的产生，使胃肠道发生强力收缩，促进胃肠运动，阻止内容物的反流[14]。研究表明调节胃肠MMC III期样收缩的血浆胃动素主要来源于胃肠黏膜Mo细胞。即当胃肠运动增加时，由于挤压胃肠壁，Mo细胞分泌胃动素，血中胃动素含量升高，诱导MMC产生[15]。激动胃动素受体能增加下食管括约肌压力和胃内压。GERD患者血浆MTL和Ghrelin水平较正常对照组下降，存在胃排空延迟。GAS作用于整个胃肠道，可刺激消化腺分泌，加强胃肠道运动[16]。GAS水平上升可导致基础胃酸及高峰酸排出量增加，胃蛋白酶分泌增加，加快胃肠肌收缩，从而促进胃肠运动。本实验结果显示，与对照组相比，模型组大鼠血清Ghrelin、MTL和GAS水平均下降，说明RE存在血浆胃肠激素水平减少，胃动力下降；而马齿苋多糖的中、高剂量组数据显示，马齿苋多糖能提高RE模型大鼠血清Ghrelin、MTL和GAS的水平。除胃肠激素水平失衡以外，细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α及INF-γ等也是RE发病的重要因素。IL-6因子水平影响食管平滑肌的张力；IL-8可以改变细胞形状并激活中性粒细胞，促进发生炎症；TNF-α可增加IL-6和IL-8的释放，并抑制平滑肌细胞收缩。本实验中马齿苋多糖中、高剂量组数据显示，马齿苋多糖可降低食管组织匀浆IL-6、IL-8、TNF-α及INF-γ含量，提示有抗炎作用。

综上，本实验结果证实马齿苋多糖可明显增加RE模型大鼠胃排空率，抑制幽门括约肌自发收缩，改善胃肠动力。这可能与其降低VIP，升高血清Ghrelin、MTL和GAS水平，降低食管组织IL-6、IL-8、TNFα及INF-γ含量有关。