Beclin1及miRNA-130a与HBV相关慢加急性肝衰竭患者预后的相关性

陈崇高 符厚萱 王小智 谢会忠

据调查，国内属HBV感染流行地区，其中HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患病率占所有急性肝衰竭的70%以上，由于其病情危重，救治困难，导致死亡率达60%～80%[1-2]。目前该病病理生理机制尚未阐明，有研究显示，自噬参与肝病(如肝癌等)病理过程[3-4]。尤其是关于血清Beclin1表达，其虽可反映机体自噬状况，但在HBV-ACLF发病机制中的作用尚未明确。另有报道认为，血清miRNA与肿瘤的发生及发展密切相关，尤其是血清miRNA-130a表达，其在癌细胞增殖及转移过程中意义重大，但现阶段关于其与HBV-ACLF患者预后的关系仍有待证实[5]。

资料与方法

一、一般资料

选择HBV-ACLF患者132例，纳入时间为2016年8月至2019年8月，已通过医院伦理委员会审核。HBV-ACLF诊断参考相关标准[6]，慢性肝病前提下4周内有消化道症状、失代偿腹水、乏力、黄疸出现；不伴或伴肝性脑病；INR为1.50及以上或PTA为40.00%及以下(其他凝血异常原因排除)。排除丙或丁型肝炎及其他肝病；排除各种恶性肿瘤和急慢性感染、肾功能不全及其他病因所致免疫复合物肾炎。根据入院治疗6个月生存情况，将患者分为死亡组(67例)和生存组(65例)，并选取同期入院的62例健康体检者为正常对照组。三组基线资料无显著差异(P>0.05)。

二、研究方法

(一)血清Beclin1检测 清晨空腹采集血清标本，酶联免疫吸附分析法测定Beclin1(上海江莱生物科技有限公司)。

(二)血清miRNA-130a检测 血清总RNA提取参考mirVana miRNA分离试剂盒(美国Ambion公司)进行，后行RNA纯度测量。参考GenBank数据明确待测基因序列，设计引物(表1)，行PCR反应。PCR反应条件：93 ℃ 5 min，93 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环40个，行PCR扩增，采集荧光，检测血清miRNA-130a表达量。PCR基因扩增仪2720购自美国ABI公司，RT-PCR试剂盒购自美国Thermo公司，miRNA-130a、β-actin引物序列均购自美国Abmart公司。

表1 PCR引物设计

三、统计学分析

结 果

一、 比较两组患者血清Beclin1及miRNA-130a表达情况

对于血清Beclin1，死亡组较生存组及正常对照组明显升高(P<0.05)，生存组较正常对照组明显升高(P<0.05)；对于血清miRNA-130a，死亡组和生存组较正常对照组明显升高(P<0.05)，死亡组较生存组显著下降(P<0.05，表2)。

表2 血清Beclin1及miRNA-130a表达分析(±s)

二、血清Beclin1及miRNA-130a对患者预后的诊断价值

通过ROC曲线分析，显示血清Beclin1及miRNA-130a对患者预后均有一定诊断价值，曲线下面积分别为0.811、0.836(表3)。

表3 血清Beclin1及miRNA-130a对HBV-ACLF患者预后的诊断价值

讨 论

HBV-ACLF属一种特定综合征，病情凶险，可致肝功能急性退化及其他多个器官病变，可能与免疫损伤等密切相关[7]。寻找该病早期诊断和预后指标尤为必要[8]。

本研究中，死亡组和生存组血清Beclin1较正常对照组明显升高，可能与HBV-ACLF的发生发展密切相关。梁振国等[9]也发现相较于健康体检者，HBV-ACLF患者血清Beclin1显著升高，证实了本结论。自噬在诱导细胞增殖、死亡及保持细胞内环境稳定中意义重大，而Beclin1属调控自噬现象的重要蛋白质，在自噬启动过程中发挥着关键作用。笔者推测，肝细胞大量坏死及肝细胞再生障碍参与HBV-ACLF发病过程，而患者肝细胞自噬异常激活在该病的发生中意义重大。当机体出现不同病毒入侵时，肝细胞内自噬功能可能不尽相同，尤其是HBV感染可经两种途径(乙肝病毒X蛋白及小表面Ⅰ蛋白)引起自噬。有研究表明，HBV可激发细胞自噬水平，促使自身载量水平上升[10]。另有研究发现，在启动细胞凋亡过程中，Beclin1可被已激活的Caspase蛋白剪切，形成C端Beclin1，通过结合线粒体并大量释放细胞色素C，致细胞凋亡[11-13]。而本文中，发现死亡组血清Beclin1较生存组高，且血清Beclin1对患者预后有一定诊断价值，进一步证实肝细胞自噬异常可能参与该病的发生及发展。笔者推测，细胞自噬可诱导HBV病毒复制增强，加速肝脏病变进行性恶化，导致预后较差，故而随着病情严重程度的增加，血清Beclin1表达逐渐上升，影响患者预后。

本研究中，死亡组和生存组血清miRNA-130a均较正常对照组高，表明HBV-ACLF患者出现肝细胞受损时，大量miRNA-130a被释放入血；而死亡组该项指标较生存组低，表明miRNA-130a与患者预后密切相关。高飞等[14]发现对于miRNA-130a相对表达量，健康体检者较HBV-ACLF患者明显下降；而死亡组该指标较生存组明显下降，表明患者预后与血清miRNA-130a密切相关，证实了本结论。薛扬等[15]也证实对于HBV-ACLF患者预后判断，血清miRNA-130a可纳为有效生物学标志物。分析原因，该指标参与淋巴细胞定向转移及趋化性发展，且可诱导内皮细胞、淋巴细胞、上皮细胞、中性粒细胞趋化因子受体被激活，诱导淋巴细胞与肝脏病变组织黏附结合[16-18]。笔者推测，患者发病时该项指标呈高表达，预示患者机体免疫反应明显增强，预后良好。本研究中，发现该指标对患者预后有一定诊断价值，进一步证实了上述结论。该指标可经碱基互补配对特异性结合目标RNA编码区，诱导RNA翻译，调节淋巴细胞至血管内壁的锚定融合，导致免疫细胞摆脱病变靶细胞束缚，产生免疫细胞因子，影响患者预后。