不明原因肝病生物样本库的建立与管理

宋金云 赵宏宇

随着医疗技术的发展以及乙型肝炎疫苗的普及，传染性肝病的发病率逐渐下降，而不明原因肝病患者呈增多趋势。“不明原因肝病”是指无诱因的持续或反复肝功能生化指标异常，或肝脏影像学检查异常，通过常规的病史询问、体格检查和实验室检查仍不能明确病因，部分患者因不能及时明确病因而延误治疗，导致病情持续进展[1]。

不明原因肝损伤病因繁多，常见的有：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、药物性肝损伤(DILI)、自身免疫性肝病[包括自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)]、遗传性代谢性肝病(Caroli综合征、Alagilli 综合征、先天性胆道闭锁等遗传性发育异常，以及肝组织铜、铁、卟啉、氨基酸、尿素、糖、果糖、乳糖、脂蛋白和脂质、胆红素、胆汁酸等代谢异常引起的肝脏疾病)、胆汁淤积性肝病、血管性肝病(累及肝静脉、门静脉、肝动脉及其分支的疾病)以及感染性病因(如隐匿性肝炎病毒感染，非嗜肝病毒、细菌、真菌、寄生虫等的感染)。此外其他系统疾病也可累及肝脏，如心血管疾病、内分泌疾病、血液系统疾病和结缔组织病等[2-3]。

生物样本库建设是临床医学研究的基石，它作为基础研究成果向临床应用转化的平台，在疾病诊断、新药研发、疾病相关基因检测及流行病学研究中均有重要作用[4-5]。有效的生物样本是开展基础研究的前提，基于此，不明原因肝病生物样本库收集和存储我院肝病科不明原因肝病住院患者的血浆、白膜层以及外周血单个核细胞(PBMC)样本，并将样本捐献者的临床信息和样本的编码信息录入南京市多中心生物样本库系统，为不明原因肝病的进一步研究提供实验样本和详细的临床资料。

资料与方法

一、研究对象

收集2018年7月至2019年6月于南京中医药大学附属南京医院(南京市第二医院)肝病科就诊的肝功能异常住院患者，通过病史、各种常规化验及辅助检查不能明确病因，均行肝穿刺活检，共191例，其中男性67例，女性124例。本生物样本库通过了南京中医药大学附属南京医院(南京市第二医院)伦理委员会审查，所有研究对象均签署了知情同意书。

二、主要仪器耗材

-196 ℃液氮罐(Thermo)、-80 ℃超低温冰箱(DW-HL668)、冷链监控系统(Haier)、低温生物标本转移箱(BIO-CARRIER)、低温离心机(Thermo Scientific SL 16R)、制冰机(GRANT)、电泳仪(DYY-2C)、凝胶成像系统(Tanon-1600)、超微量分光光度计(Thermo)、条码打印机(L-MARK)、扫码枪(Honeywell)、冻存管和冻存盒(万格)。

三、样本的采集、处理与保存

采集不明原因肝病住院患者全血样本各两管，每管5 mL，样本采集后立即置于低温生物标本转移箱，低温运输至实验室，由生物样本库专职人员离心分装：①3 500 r/min离心10 min，分离血浆与白膜层，血浆分装冻存管4～10管，200 μL/管。白膜层分装冻存管1～2管，400 μL/管；②根据临床工作的具体情况，按照标准步骤提取PBMC。所有样本均在生物安全柜中分装，并分别在冻存管上贴上条码标签。

四、样本入库与信息管理

样本库专职人员登录南京市多中心生物样本库系统，对样本实行条码扫描存储，录入患者的一般信息(住院号、姓名、性别、年龄、民族、联系方式、临床诊断、病理诊断、治疗方案、随访信息等)、样本信息(样本类型、样本编号、入库时间、位置登记号等)以及肝穿刺病理信息。

五、样本质量控制

DNA和RNA通常作为生物样本质量分析的标准，抗凝血中的白膜层是体细胞核酸的主要来源[6-7]。随机抽取5例白膜层样本，按照Qiagen QIAamp DNA Mini Kit说明书提取样本DNA，按照Trizol抽提法提取样本RNA。

结 果

一、样本收集情况

自2018年7月至2019年6月，生物样本库共纳入不明原因肝病患者191例，183例患者得到明确诊断，其中NAFLD 42例(21.98%)，PBC 20例(10.47%)，DILI 30例(15.71%)，AIH 29例(15.18%)，血管性肝病20例(10.47%)，酒精性肝病7例(3.66%)，重叠综合征12例(6.28%)，胆汁淤积性肝病11例(5.76%)，遗传性代谢性肝病5例(2.62%)，感染性病因3例(1.57%)，其他系统疾病4例(2.09%)，原因未明8例(4.19%)。不明原因肝病生物样本库共收集了2 007份样本，其中血浆样本1 625份，白膜层样本333份，PBMC样本49份。同一患者收取的样本类型根据临床工作的具体情况而定，并非所有样本全部收取。

二、样本质量控制

DNA质量鉴定：从现存的样本中随机抽取5例白膜层样本。将抽提的DNA 经 1% 琼脂糖凝胶电泳后可见条带清晰(图A)，无明显 DNA 降解，证明所存储标本的 DNA 质量良好。

RNA质量鉴定：从现存的样本中随机抽取5例白膜层样本，将抽提的总 RNA 经 1% 琼脂糖凝胶电泳后，基本上可见明显的 28 s 和 18 s 条带(图B)，且28 s 条带的亮度为 18 s 亮度的 1.5～2.0 倍。提示 RNA 保存效果良好。

图 随机抽取5例白膜层样本的DNA和RNA电泳图

讨 论

随着精准医疗的发展，在进行个性化治疗和临床研究时越来越离不开生物样本的支持，生物样本库资源及其临床数据库受到广泛重视[8-9]。人体生物样本库在国外已有多年历史，已经建立了血清生物样本库以及组织库[10-11]，国内样本库处于初级阶段，目前黑龙江中医药大学附属第一医院妇科生物样本库[5]、哈尔滨医科大学附属第二医院结直肠肿瘤生物样本库[12]、湖北省中医院超重/肥胖人群生物样本库[4]、中山大学附属第五医院生物样本库[7]等样本库已经初步建立，但是针对不明原因肝病人群的生物样本库建设较少见。

南京中医药大学附属南京医院作为江苏省唯一的三级甲等传染病医院，肝病患者较多，这为我院的不明原因肝病生物样本库提供了宝贵的样本资源。为了收集和整合肝病科室分散的临床资源，由肝病专家杨永峰建立的不明原因肝病研究团队牵头，南京市重点实验室经费支持，我院于 2016 年底开始筹建不明原因生物样本库。我院样本库收集的191例患者中NAFLD、DILI和AIH患者占了较大比例，这与国内张思敏等[13]研究结果相一致。

高质量生物样本的使用，是转化医学进一步发展的关键因素，所以生物样本的质量控制是样本库的关键[14-15]。根据我院实际情况，不明原因肝病生物样本建立了规范化的样本收集流程，同时定期对样本进行质量检测。本研究中随机抽样检测的5例样本核酸均无明显降解，证明按照目前收集存储管理流程收集的不明原因肝病生物样本质量良好，能够满足后续实验需求。

我院不明原因肝病生物样本现为建设初期，在建设过程中也总结了一些经验和遇到的问题：①在标本采集过程中，样本离体时间和样本入库时间是影响样本质量的关键因素。因此，我们有专职工作人员配合医生护士，确保血浆和白膜层样本离体后能在2 h内存入超低温冰箱，避免样本核酸降解和蛋白异常表达。样本存储后，确定样本质量是否合格，为后续进行科学研究提供高质量标本。②临床医生重视度不够，留取样本积极性不高。因此，我们定期对临床医生开展样本库介绍，推广样本库共享理念，鼓励临床医生收集样本，沟通科研设计思路。③加强样本库工作人员培训力度，定期进行业务知识培训，执行样本库标准化收集与管理流程。

我院初步建立了不明原因肝病生物样本库，制定了标准化的样本库运行和管理规章制度，每一份样本都携带完整的临床信息。同时，在不断整合本院自身资源的同时，与国内多个分中心建立长期良好合作关系，深入开展不明原因肝病的基础研究，为今后不明原因肝病的进一步研究提供高质量的样本资源，对研究不明原因肝病具有十分重要的意义。