卵巢癌组织中miR-377的表达及其与临床病理参数的关系

杨晓东

卵巢癌为危害女性健康的三大妇科肿瘤之一，在妇科恶性肿瘤中病死率居首[1]。据国际癌症研究机构2016年癌症统计数据，卵巢癌是美国癌症相关死亡的第五大常见原因，2016年估计有22 280例新病例和14 240例死亡[2]。在中国，卵巢癌的发病率和死亡率在过去10年中再度增加[1,3]。由于卵巢解剖位置的隐蔽性及早期症状不明显，70%～80%病人确诊时已属晚期，这给卵巢癌的诊断、治疗提出了不小的挑战。临床工作中，CA125已成为卵巢癌术前诊断、评估疗效、监测复发、预测预后的指标之一，但其敏感性不高，特异性不强，难以起到早期诊断的作用[4-5]。因此探索卵巢癌的致病因素及寻找特异性早期诊断的分子标志物成为卵巢肿瘤基础与临床研究的热点。

目前，microRNA已成为肿瘤的新型潜在诊断生物标志物[1]。其中，miR-377是DLK1-DIO3基因簇区域中54个miRNAs中的一员，这一54miRNAs基因簇是人类基因组中目前所知的最大的miRNAs基因簇[6]。研究[7-8]发现miR-377可以通过调节信号通路参与多种人类肿瘤疾病的生物学过程，其中包括胰腺癌、胃癌等。但miR-377在卵巢癌病人中表达及其与临床病理参数的关系尚待深入。因此研究选取50例卵巢癌病人，考察其肿瘤组织与同期正常卵巢组织miR-377的表达，进一步探究miR-377的表达与临床病理相关参数及预后的关系。现作报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2013年1月至2014年1月手术治疗的卵巢癌病人卵巢肿瘤组织标本50例(卵巢癌组)。年龄34～68岁；收集的所有肿瘤组织参照《恶性肿瘤TNM分期》：Ⅰ期7例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例，Ⅳ期8例；高分化10例，中分化17例，低分化23例。纳入标准：(1)术前明确诊断为卵巢恶性肿瘤；(2)均行手术切除，术后留取组织证实为卵巢恶性肿瘤；(3)临床病理资料完整，完成本研究中所有调查项目者。排除标准：(1)有放化疗史者；(2)合并其他恶性肿瘤病人。同时收集正常卵巢组织样本50例作为对照组。2组研究对象一般资料均具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 样品收集与制备 手术中收集新鲜的肿瘤标本及同期正常卵巢组织，匀浆后使用Trizol试剂(Invitrogen，USA)提取RNA。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-377表达 配制miRNA反转录反应液对上述制备的总RNA中的miRNA进行反转录。冰上配制miR-377的qPCR反应液，混匀后加入PCR反应管中，离心并将混合物加入多孔板，多孔板置于PCR仪中，两步法进行退火反应：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，扩增40个循环。绘制光谱和溶解曲线，软件分析样品的Ct值，以U6为内参，2-△△Ct法计算miR-377表达量。实验引物由上海生工生物公司设计合成。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3 观察指标

1.3.1 miR-377表达与临床病理参数的关系 记录病人的年龄、T分期、N分期、是否转移、临床分期、病理分级及卵巢癌类型，比较不同病理类型病人间miR-377表达差异，分析miR-377表达与卵巢癌发生和发展的关系。

1.3.2 miR-377表达与卵巢癌预后的关系 术后随访5年，每6个月随访1次，采用电话随访或病人回院复查相结合的随访方式。根据miR-377表达情况分为高表达组和低表达组2个亚组，以miR-377/U6=1为标准，相对表达量>1记为“+”，即高表达，相对表达量<1记为“-”，即低表达。以此为基础，考察miR-377表达与卵巢癌病人的临床病理参数的关系。绘制2组术后5年生存曲线图，比较2个亚组生存率分布。

1.3.3 多因素COX回归分析 采用多因素COX回归分析，评价miR-377是否可以作为卵巢癌预后的独立危险因素。

1.4 统计学方法 采用独立样本t检验、秩和检验和χ2检验；Kaplan-Meier法建立生存模型，行Log-rank检验分析生存率差异；采用多因素COX回归分析卵巢癌预后的独立危险因素。

2 结果

2.1 miR-377表达与临床病理参数的关系 与对照组比较，卵巢癌组miR-377表达降低，差异有统计学意义(P<0.01)(见表2)。不同T分期、N分期、临床分期及是否转移的卵巢癌病人，其miR-377表达差异有统计学意义(P<0.05～P<0.01)。不同年龄、病理分级及卵巢癌类型卵巢癌病人的miR-377表达差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

表2 卵巢癌组与对照组miR-377表达比较

表3 miR-377表达与临床病理参数的关系[n；百分率(%)]

2.2 miR-377表达与卵巢癌预后的关系 50例卵巢癌病人中miR-377低表达者34例，高表达者16例。Kaplan-Meier法绘制卵巢癌病人5年总生存曲线(见图1)。由图可见，miR-377低表达与高表达卵巢癌病人的5年总生存率分别为55.9%、75.0%，差异有统计学意义(χ2=12.61，P<0.01)。说明miR-377高表达者生存曲线图优于低表达者，miR-377低表达影响卵巢癌预后及生存率。

2.3 多因素COX回归分析 本研究以上述卵巢癌病人为样本，建立COX比例风险回归模型。应变量为卵巢癌病人预后(分别赋值1=死亡，0=生存，生存时间t)。自变量为病人的T分期、N分期、是否转移、临床分期、病理分级及miR-377表达。回归过程采用后退法，α出=0.05。

结果显示，T分期、N分期、是否转移及miR-377表达进入回归结果。相对危险度(OR)依次为2.459、2.365、2.517、2.048。其中T分期、N分期、是否转移可简称TNM分期。提示TNM分期及miR-377表达为预后的独立危险因素(P<0.01)(见表4)。

表4 多因素COX回归分析

3 讨论

卵巢癌是妇科生殖道三大恶性肿瘤之一，其发病率虽然位居子宫颈癌和子宫体癌之后，但其死亡率却居于首位。不同期别卵巢癌其生存率差异极大，早期卵巢癌病人通过手术、化疗其5年生存率能达到90%以上，但晚期卵巢癌病人5年生存率仅20%～30%[9-10]。化疗是目前卵巢癌有效的辅助治疗手段，而化疗药的不良反应常限制其用药剂量和时程，使得化疗药难以清除体内的肿瘤细胞，导致临床上肿瘤治疗的失败及病人预后不佳。基因靶向治疗可降低药物的不良反应，已成为当今研究的热点。与卵巢癌发生发展密切相关的癌基因及抑癌基因已被逐步发现[11-12]，但它们的异常传导途径在肿瘤侵袭转移中的机制还有待进一步研究，且由于肿瘤的发生机制复杂，在恶性肿瘤中存在基因突变，抗单基因的抑制剂或者单抗药物的应用范围并不广，使基因药物的应用受到限制。基于此，目前急需研发一靶多向的基因治疗方法。

MEG3是目前肿瘤研究最为广泛的转录体RNA[13]，miR-377位于MEG3的下游，被证实参与细胞周期调控、分化、衰老及凋亡等生物学过程[14-15]，尤其是作为一种重要的抑癌基因广为研究[16]。本文选择miR-377基因，考察其于卵巢癌组织的表达水平。结果发现，与对照组比较，卵巢癌组miR-377表达显著降低，与已有的胰腺癌[7]、胃癌[8]研究一致。进一步研究发现，卵巢癌组miR-377表达与肿瘤的TNM分期、临床分期、病理分级有关，但与病人的年龄、卵巢癌类型等临床病理参数无关。同时对卵巢癌病人进行5年随访，其5年生存曲线显示miR-377低表达者5年生存率显著低于高表达者，提示miR-377的表达影响卵巢癌的生存率。

预后在肿瘤治疗中至关重要[17]。因预后的影响因素众多，卵巢癌病人的预后评估始终是临床上面临的难题[18]。目前，临床分期常被认为是卵巢癌等恶性肿瘤预后的危险因素[4,19]。且据报道，miR-377发挥抑癌基因作用[7-8,20]。本文COX回归分析显示，miR-377低表达与TNM分期是卵巢癌预后的独立危险因素。这可能是由于随临床分期的推进，接受手术治疗的卵巢癌病人更容易复发所致。同时，上述研究表明miR-377低表达与卵巢癌的生存率降低有关，推测miR-377低表达可用于预测卵巢癌病人的预后情况。

综上所述，miR-377在卵巢癌病人组织中的表达显著降低，miR-377表达水平与卵巢癌病人的TNM分期、临床分期及病理分级有关，且miR-377低表达与TNM分期可视为卵巢癌预后的独立危险因素。提示miR-377可作为评估卵巢癌病理参数程度和病人预后的有效生物学标志物。