中华小型猪急性心肌梗死后心肌炎症模型的建立和验证

田毅，李巨波，张宝杰，魏红星，张晓丽

1.首都医科大学附属北京安贞医院核医学科，北京 100029；2.中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外医院动物实验中心，北京 100037；3.中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外医院核医学科，北京 100037；*通讯作者 魏红星 weihongxing@263.net

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后早期梗死区域可发生持续的炎症反应，主要包括2个发展阶段，第一阶段的高峰在AMI后最初数小时到数天内，以中性粒细胞浸润为主，主导坏死心肌的清除；第二阶段的高峰在AMI后3～10 d，以巨噬细胞浸润为主，主导心肌修复[1-3]。近年研究表明AMI后的炎症反应，特别是第二阶段的炎症反应与左心室重构和预后有关[4-5]。因此，建立与人类接近的AMI 炎症动物模型，通过分子显像结合病理分析评估AMI后的炎症反应进程，对于明确AMI后炎症反应的潜在病理生理学机制、建立精准的临床急性心肌梗死干预方法具有重要意义。

与小动物相比，大动物AMI后炎症反应更强烈，持续时间更长，更接近患者的AMI 炎症反应状态[6]。在各种常见大动物中，猪的心脏解剖结构及心率、凝血因子和纤溶活性等心脏生理指标与人的心脏尤为接近，且在进行AMI 建模过程中心肌梗死面积大小具有较高的可控性。

在炎症反应评价方面，由于活化后的炎症细胞糖酵解速度和细胞膜表面的葡萄糖转运体（glucose transporters，GLUTs）数量增加，因此炎症反应部位葡萄糖代谢活性可以反映炎症反应的程度，18F-FDG PET/CT 作为无创的葡萄糖代谢显像技术，能够较好地评价炎症反应[7-9]。

本研究拟建立中华小型猪AMI 炎症模型，并采用病理分析及18F-FDG PET/CT评价是否建模成功，以期提供用于AMI后炎症反应临床转化研究的模型建立和评价的可靠方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康中华小型猪15只[天津市百农实验动物繁育科技有限公司（合格证号：No.12002600000321）]，6月龄，体重25～30 kg，雌雄不限，饲养环境和实验环境均为普通级。按简单随机抽样法分为AMI组、正常对照组和假手术组，每组5只。实验猪建模后，待麻醉恢复正常后送回适宜恒定温度和湿度的饲养间，每只饲养在固定的笼具中，每天给予2次适量的常规饲料喂养，通过自动饮水系统自动饮水。本实验根据赫尔辛基宣言使用动物并对动物进行护理。动物实验伦理批准号ZH16002。严格遵守《北京实验动物管理条例》及欧洲实验动物监护指南。

1.2 仪器 C 型臂X线机（OEC9900，通用电气）；心电图仪（BeneHeart R3A，深圳市迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；SPECT/CT（Symbia Intevo16，西门子）；冠状动脉球囊扩张导管（NC Trek RX Coronary Dilatation Catheter）等。

自制栓子：将球囊于1/2 处截断，取直径适合的凝胶海绵置入球囊前段内，并检查确定其稳固性。凝胶海绵可于冠状动脉内吸收血液形成血栓，达到充分且永久地封堵冠状动脉的效果。

1.3 动物模型制作 使用经皮冠状动脉球囊结合凝胶海绵联合栓塞法制作AMI模型。具体操作步骤：实验猪禁食12 h后，肌注舒泰1.25 mg/kg 行诱导麻醉。于耳缘静脉建立静脉通路，行气管插管，连接呼吸机及心电监护仪，全程监测心率、血压、脉搏血氧、呼吸频率等生命体征。通入异氟烷维持麻醉。将猪仰卧位置于实验台上，给予肝素200 μl/kg 抗凝，右侧腹股沟备皮，常规消毒后铺巾，动脉穿刺后置入6F下肢鞘管。采用左前斜位（45°），在C 型臂X线机透视下经鞘管将指引导管插入动脉，通过造影导丝导引指引导管至升主动脉，退出导丝，再次导引指引导管依次进入左冠状动脉窦、左主干、左前降支（left anterior descending artery，LAD）开口处，使导管开口与冠状动脉开口同轴。注入碘普罗胺注射液行冠状动脉造影，定位第一对角支，将指引导丝通过指引导管小心插入冠状动脉左前降支远端，再沿导丝推送自制球囊至第一对角支以下约1～2 mm 处。退出导丝及球囊，留置前半部自制栓子于此位置。5 min后造影确认阻断血流后，再依次退出导管及鞘管，按压主动脉止血后结束手术。假手术组除不使用栓子进行血流阻断外，其余操作均与AMI组一致。正常对照组不做特殊处理。

1.4 心肌灌注显像 采用99Tcm-MIBI 心肌灌注显像评价实验猪手术前后心肌血流灌注情况，验证AMI模型是否成功，并明确心肌梗死部位。采用Siemens Symbia T16 型双探头SPECT/CT 仪。显像前禁食、禁水 12 h，常规麻醉实验猪后，经耳缘静脉注射99Tcm-MIBI 370 MBq，45 min后取仰卧位置于检查床上，采集断层图像。采集条件：低能高分辨准直器，两探头夹角90°，能峰140 keV，窗宽±20%，采集时间35 s/帧，6°/帧。采用Butterworth 滤波器（截止频率0.35 cycles/cm 和阶数5.0）进行滤波反投影图像重建，图像矩阵大小128×128，放大倍数1.45。

1.518F-FDG 显像 采用高脂低碳餐+禁食+肝素的方法抑制实验猪心肌生理性摄取[10]。显像前1 d 给实验猪喂食高脂低碳餐，随后禁食12 h。常规麻醉后，静脉注射肝素50 IU/kg，15 min后静脉注射18F-FDG 6～8 MBq/kg，1 h后仰卧位置于PET/CT检查床（Siemens Biograph 64 型PET/CT 仪）。采集胸部CT用于衰减校正（CT 采集参数，管电压120 kV、管电流10 mA）和解剖定位，随后进行心脏PET 采集，时长10 min。采用3D-OSEM（子集个数21，迭代次数2）方法对PET/CT图像进行重建。用MedEx 软件对PET/CT图像进行定量分析。在心肌前壁（AMI组梗死区）勾画感兴趣区，获取最大标准化摄取值（SUVmax）。假手术组和AMI组实验猪于术后第5天行PET/CT检查（图1）。

图1 实验流程。AMI组和假手术组分别于术前1 d 行99Tcm-MIBI 心肌灌注显像，术后5 d 行99Tcm-MIBI 心肌灌注显像和18F-FDG PET/CT 代谢显像，正常对照组在AMI组和假手术组术后5 d 行 99Tcm-MIBI 心肌灌注显像和 18F-FDG PET/CT 代谢显像，显像完成后即刻在麻醉状态下处死实验猪

1.6 组织学分析 显像完成后即刻在麻醉状态下处死实验猪，快速取出心脏，并用生理盐水冲洗。在左心室靠近中间的部位取前壁（AMI组梗死区）心肌组织，用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成5 μm 厚切片。用HE 染色和马松染色观察心肌组织形态学改变，采用免疫组化法鉴别CD68+巨噬细胞及GLUT-1、GLUT-3和GLUT-4 的表达。使用光学电子显微镜观察切片。

1.7 统计学方法 应用SPSS 23.0 软件，计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验均符合正态分布，以±s表示。3组18F-FDG 摄取值比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型验证 AMI组实验猪造模前后心电图、血管造影及心肌灌注显像见图2。造模术前心电图正常，术后心电图显示对应胸部导联均产生AMI 典型改变，包括前壁导联ST 段弓背型抬高、对侧心室壁导联ST段压低等。血管造影示术前冠状动脉血流正常，术后前降支栓塞部位远端无造影剂通过。心肌灌注图像显示术前左心室各壁心肌示踪剂分布均匀，未见示踪剂摄取减低或缺损区，提示左心室各壁心肌血流灌注正常。术后图像显示前降支支配区域心尖和前壁呈示踪剂摄取缺损区，提示左心室心尖和前壁心肌梗死。

HE 和马松染色显示正常对照组和假手术组心肌细胞结构完整，排列整齐。AMI组梗死区显示大量心肌细胞坏死，细胞排列紊乱，大量炎症细胞浸润及胶原蛋白沉积（图3）。

图2 AMI组实验猪球囊扩张术前和术后心电图、血管造影及心肌灌注显像图。术前心电图正常（A），术后心电图示前壁导联ST 段弓背型抬高，对侧心室壁导联ST 段压低（B）；血管造影示术前冠状动脉血流正常（C）；术后前降支栓塞部位（箭）远端无造影剂通过（D）；心肌灌注图像示术前左心室各壁心肌血流灌注正常（E）；术后心尖和前壁呈示踪剂摄取缺损区，提示左心室心尖和前壁心肌梗死（箭，F）

2.218F-FDG 摄取 通过禁食联合高脂低碳餐和静脉注射肝素的方法，15只实验猪正常心肌的生理性摄取均被充分抑制。18F-FDG PET/CT图像和对应的半定量分析见图4。PET/CT图像示正常对照组和假手术组均未见明显18F-FDG 摄取。AMI组心尖和前壁（图2所示的血流灌注减低区）18F-FDG 摄取明显增高。AMI组SUVmax为4.32±0.58，明显高于正常对照组的1.10±0.10 及假手术组的1.08±0.08，差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.3 巨噬细胞浸润和GLUT表达 免疫组化结果显示，与正常对照组和假手术组比较，AMI组梗死区有大量CD68+巨噬细胞浸润（图5）。AMI组梗死区GLUT-1 和GLUT-3表达强度明显高于正常对照组和假手术组。3组GLUT-4 均仅有微弱表达（图6）。

图3 实验猪HE（A～C）和马松染色图（D～F）。正常对照组和假手术组心肌细胞结构完整，排列整齐，无炎症细胞浸润（×100，A、B）和胶原沉积（×100，D、E）；AMI组梗死区心肌细胞大片坏死，大量炎症细胞浸润（×100，C）和胶原沉积（×100，F）

图4 实验猪 PET/CT图（A）及SUVmax（B）比较。AMI组梗死区FDG 摄取（箭）明显高于正常对照组及假手术组，SUVmax 4.3

图5 实验猪心肌组织CD68+免疫组化染色。正常对照组（×400，A）和假手术组（×400，B）未见巨噬细胞浸润，AMI组梗死区大量巨噬细胞浸润（×400，C）

3 讨论

AMI 激发炎症反应，炎症因子的释放使大量炎症细胞向梗死区募集浸润。AMI后的炎症反应与左心室重构和预后有关，其细胞类型、时间进程、强度和范围均影响组织修复过程，炎症反应过激或不足均会对左心室重构和预后产生不良影响[11-12]。建立AMI 炎症动物模型有助于研究炎症反应机制。本研究用中华小型猪建立AMI 炎症反应模型，并通过18F-FDG PET/CT评估炎症反应，为AMI 炎症反应相关的临床转化研究提供可靠的建模和评价方法。

AMI后的血液生化检查仅能提供系统性炎症信息，无法评估心脏局部的炎症情况。CT检查主要提供心脏和血管的解剖学信息，无法评价心脏局部的炎症情况。近年较多研究使用18F-FDG PET显像评价炎症反应，但由于正常心肌生理性摄取的不可预测性，给显像前准备和图像解读带来很大挑战。目前，部分抑制心肌生理性摄取的方法应用于动物及临床研究，如长时间禁食[13]、高脂低碳餐[14-15]或静脉注射肝素[16-17]，这些方法在大多数临床研究中均有效。然而，由于大多数麻醉剂会影响大鼠或小鼠心肌葡萄糖代谢，以致这些抑制心肌摄取的方法在小动物体内效果不显著[18]。因此，啮齿类动物并非研究AMI后炎症反应的最佳选择。Manabe 等[10]采用高脂低碳餐+禁食+肝素的组合方法抑制结节病患者的心肌生理性摄取，其有效抑制率高达100%。本研究采用相同的方法缓解了麻醉剂对心肌葡萄糖摄取的干扰，实验猪心肌生理性摄取的有效抑制率高达100%，获得了良好的图像质量，为图像解读提供了便捷。

图6 实验猪GLUT-1、GLUT-3 和GLUT-4 免疫组化染色。正常对照组（A、D）和假手术组（B、E）GLUT-1和GLUT-3表达微弱（×400）；AMI组梗死区有明显的 GLUT-1 和GLUT-3表达（×400，C、F）；正常对照组、假手术组和AMI组GLUT-4均仅有微弱表达（×400，G～I）

炎症细胞主要通过GLUT-1 和GLUT-3 摄取葡萄糖[18]。本研究免疫组化结果显示梗死区有大量CD68+巨噬细胞聚集。与正常对照组和假手术组比较，梗死区GLUT-1 和GLUT-3表达强度明显增加。PET/CT显示梗死区18F-FDG 摄取明显增加，免疫组化和PET结果表明梗死区18F-FDG 信号主要反映炎症细胞的葡萄糖摄取。另外，正常心肌细胞主要表达GLUT-4，GLUT-4 由细胞内向细胞膜的转位过程是限制心肌葡萄糖摄取的关键步骤。本研究中，3组GLUT-4 均仅有微弱表达。GLUTs 的表达验证了高脂低碳餐+禁食+肝素的方法抑制心肌生理性摄取的有效性，并在一定程度上揭示了心肌生理性摄取抑制的机制，也进一步证实梗死区18F-FDG 信号与AMI后梗死区的炎症反应有关。然而，本研究根据既往报道选择AMI后的炎症高峰时点进行研究，并未对AMI后的炎症反应进行动态观察；另外，18F-FDG 信号虽然能够反映炎症水平，但其并非炎症的特异性显像剂。未来需要使用新型的炎症细胞特异性显像剂通过动态观察，进一步研究不同亚型炎症细胞在AMI后不同阶段的作用特点。

总之，本研究证明中华小型猪模型适用于AMI后炎症反应的评估和临床前研究。18F-FDG PET/CT可以无创地评价AMI后心脏局部的炎症反应，并可在梗死大小、心脏几何容积和功能之外提供有价值的信息。