畜禽粪便中抗生素残留检测技术研究进展

王晓燕 张航俊 张晓丽 商小金 林仙军

[浙江省动物疫病预防控制中心（浙江省兽药饲料监察所）311199]

抗生素能促进动物生长，预防和治疗动物疾病，在畜禽养殖业中广泛应用[1]。畜禽摄入的抗生素约有60%～90%以原型或代谢产物的形式随粪便、尿液排出[2]。在农业生产中，畜禽排泄物的使用可能造成土壤微生物生态失衡[3]，导致细菌产生耐药性[4]，抗生素富集进入食物链，发生食品安全事件，给人类健康带来危害[5]。本文针对畜禽粪便基质，从检测样品前处理、检测技术等方面探讨畜禽粪便中抗生素残留的检测方法[6]，以期对研究粪便中抗生素转移、降解规律、合理使用、制定畜禽排放标准、污染评估及治理具有重要意义[7,8]。

1 畜禽粪便样品预处理

畜禽粪便成分复杂，畜禽养殖场规模、设备水平的差异与养殖场地干湿分离实施情况不同，导致粪便含水量差异大，一般情况下，粪便中水分约占3/4，其余固体成分中30%为死细菌，10%～20%为脂肪，2%～3%为蛋白质，10%～20%为无机盐，30%为未消化食物和消化液中的固体成分[9]。畜禽粪便中的有机质对抗生素有较强的吸附力，不利于提取，给畜禽粪便样品中目标化合物定量造成障碍[10,11]。如何有效去除杂质干扰成为前处理的关键。多数研究者处理粪便的程序是先把粪便干燥后，粉碎，过筛，作为检测的样品[12,13]，进行下一步提取。

1.1 提取

抗生素残留提取常用的溶剂有甲醇、乙腈等。乙腈具有较好的蛋白质沉淀作用，是优良的提取溶剂[14]。为提高提取效率，实验中通常会根据分析物的性质，在乙腈中加入辅助提取剂甲酸或氨水等，与甲酸形成酸化乙腈或碱化乙腈[15]。余佩瑶[13]比较了EDTA-McIlvaine 缓冲液（M1）、EDTA-McIlvaine 缓冲液-甲醇-乙腈-丙酮（M2）、乙腈-乙酸（M3）单独或等比例混合使用时的提取效果，发现用（M1-M2，1：1，v/v）时回收率最佳，各类化合物的平均回收率为70.0%～116.3%。通过调节缓冲溶液和有机溶剂的比例进行组合提取，有利于提取强极性目标物。在缓冲液中加入的EDTA 能有效提高四环素类物质的提取效率。使用组合溶剂时，根据目标物的种类和性质，优化溶剂种类和溶剂间的比例。另外，使用酸化乙腈和碱化乙腈时要注意酸碱度[16]。

1.2 净化

提取后的溶剂含有较多杂质，前处理过程中净化是非常重要的一步，尽量去除杂质，尽量保留待测物质。常用的净化技术有萃取和固相萃取技术(SPE)等[17]。SPE 的优点是操作方便、消耗溶剂少、可富集、去除杂质效果好。常用的固相萃取柱有HLB 和MCX 等，HLB 固相萃取柱能同时保留一个较宽范围内的亲水、亲脂化合物。

QuEChERS (Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe) 是一种常用的样品提取和净化的前处理技术，乙腈提取后，经过盐析，分散固相萃取成分，达到净化的效果[18]。

2 检测技术

2.1 高效液相色谱

畜禽粪便中抗生素残留量一般比较高，高效液相色谱法分析速度快、分离能力强、灵敏度高等特点，即可满足检测需要[19]。粪便检测方法中HPLC 法较合适，常用的检测器有紫外检测器、二极阵列检测器和荧光检测器等[20-22]，检测方法汇总见附表。

姚倩测定了海南省典型养殖场鸡/猪粪便中2 种四环素类和2 种大环内酯类抗生素的含量与分布特征，结果表明，在猪粪中，四环素类的总含量在0～8460.8μg/kg 之间，以土霉素为主；大环内酯类的总含量在0～1052.8μg/kg 之间，以泰乐菌素为主；在鸡粪中，四环素类化合物的总含量在0～2839.3μg/kg[20]。采用高效液相-荧光分析法测定了样品中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲恶唑3 种主要磺胺类药物的残留情况，结果表明，3种磺胺类药物在粪便中的总含量分别为10.13～566.23μg/kg[21]。

2.2 液相色谱-串联质谱技术（HPLC-MS/MS）

在养殖过程中，通常检测样本的选择主要是关注活体采样的便利性、非破坏性和前处理的便捷性，如动物尿样和动物饲料。但样本的真实性会存在一定问题，大批量采样时也会因动物的生理特性造成阻碍[32,33]。畜禽粪便是一种具有采样便利性的动物样本，但粪便样本成分极复杂，粪便中基质对药物的吸附性及含水量等因素制约粪便作为监测对象的研究。HPLCMS/MS 定性准确，是近年来畜禽粪便中抗生素残留检测研究的重要方向。

附表 高效液相色谱测定畜禽粪便药物残留检测方法汇总表

何思远研究表明，鸡粪、猪粪和牛粪样品经加速溶剂萃取仪萃取，Oasis HLB 固相萃取柱净化，用电喷雾正离子(ESI+)多反应监测模式(MRM) 定量分析[21]。平均回收率达63.8%～103.7%，相对标准偏差小于13%，方法检出限和定量限分别在0.5～5μg/kg 和1.5～20 μg/kg 之间。畜禽粪便中磺胺类及其代谢物的检出率均在90%以上，不同样品残留量的差异较大。李丹妮[30]利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)，建立了同时测定畜禽粪便中7 种β2-受体激动剂的方法。样品经酸性乙腈提取，再用0.2%甲酸溶液稀释，提取液用阳离子交换在线净化柱(Hyper Sep Retain CX) 净化，2%氨水-甲醇溶液洗脱，在正离子电喷雾条件下，采用选择反应监测模式检测，以外标法定量。结果表明，7 种β2-受体激动剂在0.5～100μg/L 的浓度范围内线性良好。张丽丽[19]研究了北京地区规模化养猪场粪便中四环素类抗生素残留现状，结果表明，北京地区猪粪中四环素、土霉素和金霉素检出率分别为90.9%、45.5%和18.2%，四环素类抗生素合计浓度范围为0.48～29.2mg/kg。万位宁[29]建立了固相萃取-超高效液相色谱串联质谱(SPE-UPLC/MS/MS)同时测定禽畜粪便中6 种磺胺类(SAs)、4 种四环素类(TCs)、3种氟喹诺酮类(FQs)、3 种大环内酯类(MACs) 以及1 种硝基呋喃类(NFs) 抗生素残留的方法。样品分别由McIlvaine-Na2EDTA 缓冲液和有机混合提取液逐次超声提取，正己烷脱脂，过SAX-HLB 固相萃取系统，富集，净化，经氮吹、定容后，以乙腈和0.1%甲酸-水溶液为流动相进行UPLC/MS 分离检测，内标法定量。在0.1～1000μg/kg 添加浓度范围内，回收率在42.3%～79.6%。

3 结论

畜禽粪便中抗生素种类多，浓度高，人们对畜禽养殖废弃物的关注，促使畜禽粪便抗生素残留检测技术向更高的水平发展。随着科技水平的进步，越来越多新颖的技术手段和先进的仪器设备正致力于解决畜禽粪便基质成分复杂、抗生素残留种类多等难点问题，进而深入研究测定畜禽粪便中更多种类、更多组分抗生素的方法，增强检测技术的实用性，为畜禽产品质量安全和人类健康提供保障。