食物过敏口服免疫治疗

朱海涛，唐开发，刘仲伟，陈国强

近年来婴幼儿食物过敏(food allergy，FA)的发生率逐渐增加，日益发展为严重公共卫生问题，而越来越受到人们的重视[1-2]。FA是机体摄入外源性蛋白后由免疫机制介导的变态反应，可累及不同的靶器官，引起全身各个系统的临床症状(如过敏性皮炎、血管神经性水肿、腹痛、腹泻、鼻炎、慢性咳嗽、营养不良、偏头痛及过敏性休克等)，给患儿及家庭带来巨大的心理压力和经济负担，严重影响生活质量。新近研究表明，过敏性疾病与自身免疫性疾病(autoim-mune disease，AID)存在共同的基因易感性位点及通路，可能共享致病机制[3]。此外，过敏原(核桃抗原)或可通过“肇事逃逸”(hit-and-run)机制启动自身抗体的发育[4]。提示FA可能与AID的发生、发展密切相关。

目前FA的经典治疗方法是严格饮食回避。但实际日常生活中很难做到绝对的饮食回避，且长期饮食回避可能增加意外摄入致敏原时诱发严重过敏反应的风险；此外，如食物过敏原为生长发育所需重要营养要素, 可因长期避免摄入而导致蛋白质-能量营养不良，甚至引发心理疾患。传统皮下注射免疫疗法(subcutaneous immune therapy，SCIT)[5]、舌下免疫疗法(sublingual immunotherapy，SLIT)[6]、抗IgE单克隆抗体疗法(如新型生物制剂XOLAIR Omalizumab，奥马珠单抗)[7-8]则分别因全身不良反应发生率高、疗效欠佳、经济负担重等不良因素，目前难以临床大规模普及应用。

口服免疫治疗(oral immunotherapy，OIT)是指将使患儿发生过敏的食物作为抗原，从极低剂量开始口服，以后逐渐、缓慢增大剂量直至此类食物的日常摄入量，并维持一段时间，从而刺激机体形成对该抗原无应答状态，即口服耐受(oral toler-ance，OT)。从理论上来说。OIT可以发展成对任何通过口服而激活免疫系统的物质都产生耐受，因此，如果能够成功诱导免疫耐受，将对预防和治疗其他变态反应性疾病、炎性/自身免疫性疾病及抑制移植后免疫排斥反应的发生等都具有十分重要的指导意义[9-10]。

1 OIT研究概况

OIT治疗FA的理念最早可以追溯到1908年，Schofield利用口服生蛋清的方法，成功地使1例对鸡蛋过敏的患儿脱敏。随着FA患者的日渐增多，食物特异性免疫疗法(food-specific immunotherapy)于上世纪90年代再次兴起。2006年报道了2例成功对花生脱敏的OIT治疗案例[11]。2009年发布的首次开放式临床试验表明，利用花生OIT可有效地使绝大多数(27/29，约93%)花生过敏儿童达到临床脱敏；该疗法安全性良好，观察期内未见严重不良反应发生[12]。OIT可以加速食物的自然耐受过程、提高患者可耐受剂量；从而达到脱敏保护，诱导长期、特异性无应答及降低意外暴露风险的作用。OIT一般选择症状明显且难以自然缓解的FA患儿进行干预；研究最多的食物是牛奶、鸡蛋和花生，小麦、椰子、鱼类等也有报道；受试人群包括幼儿、儿童、青少年及成人；基于安全因素考虑，多数研究排除了有中重度持续性哮喘、嗜酸性食管炎、嗜酸性胃肠炎等疾病的患者[13]。

在OIT进程中，食物以天然或加工形式逐渐增量摄入，目的是建立对致敏物的永久耐受性。具体治疗方案可能存在较大区别，但通常包括初始快速剂量增加期(initial rapid dose escalation day)、逐次增量阶段(build up phase)、维持阶段(maintenance phase)(图1)。

在初始快速剂量增加期，受试者需在临床监护条件下摄入拟脱敏食物，通常以低于过敏阈值剂量起步(通常为mg)，短期内快速增量，一般于当日达到个人可耐受量(tolerated dose)。随后进入逐次增量阶段，以个人耐受剂量为基准，连续逐渐递增,每1～2周递增1次，直到达到设定的目标剂量(targeted dose)或最大耐受量(highest tolerated dose)；一般于逐次增量阶段的末期，受试者可达到脱敏状态。在维持期阶段，要求受试者每天或每周摄入目标维持剂量的致敏性食物，维持数月至数年。干预期间还应密切注意受试者有无不良反应发生。治疗期结束数周后(一般4～12周)，以是否成功通过口服食物激发试验(oral food challenge，OFC)评估OIT的疗效，进而区分是暂时性脱敏(short-term desensitization)(即过敏阈值升高/暂时性临床无反应)还是持续无应答(sustained unresponsiveness，SU)(图1)。虽然SU常被视为OT的代名词，但现有的临床试验尚未完全证实OIT可诱导真正意义的永久性口服耐受(permanent oral tolerance，pOT)。一般认为，OIT持续时间越长、受试者获得的免疫耐受性越好，延长OIT治疗时程是实现SU的必要条件[14]。

图 1 口服免疫治疗的经典流程

2 OIT的机制

OT是指通过口服抗原而在肠道黏膜免疫中诱导的一种特殊类型的外周耐受，即经肠黏膜进入的蛋白质抗原导致的全身对该抗原的无应答状态；主要由人体的肠道相关淋巴系统(gut-associated lymphoid system，GALS)来建立。当消化道黏膜屏障功能受损或和产生炎症反应时，OT的形成可受到破坏。此时，肠道上皮细胞释放炎性因子/信号，包括白介素-25(interlukin-25，IL-25)、白介素-33(interlukin-33，IL-33)、胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)等，以激活树突状细胞(dendritic cell，DC)；摄入的食物抗原经肠道抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)(即活化DC)加工处理，通过主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-肽复合物、共刺激分子及细胞因子的共同作用，激活并诱导辅助性T细胞(T helper cell，Th)分化为2型辅助性细胞(T helper cell type 2，Th2)或滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells，Tfh)；进而诱发Th2型因子释放(IL-4、IL-13、IL-5与IL-9等)，B细胞/浆细胞分化，特异性IgE抗体产生及肥大细胞/嗜碱性粒细胞脱颗粒等一系列过敏反应[15-16]。通过抑制抗原特异性Th2细胞、促进调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)分化可诱导OT产生[17]。

目前OIT的确切机制仍不十分清楚，一般认为OIT是通过利用OT途径，引起受试者在摄入食物致敏原的过程中机体(肠道局部/全身系统)发生免疫学转变，从而减轻或抑制过敏反应[18]。众多研究显示OIT干预后主要的免疫学变化为：(1)肥大细胞与嗜碱性粒细胞反应活性降低；(2)抗原特异性Th2细胞的活性与克隆扩增下降，伴随血清食物特异性免疫球蛋白E(immuno-globulin E，IgE)水平先升高后下降，血清、唾液中食物特异性免疫球蛋白G4(immunoglobulin G4，IgG4)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)均升高；(3)诱导调节性T细胞(induced regulatory T cell，iTreg)活化及增殖[12, 19-20]。肥大细胞与嗜碱性粒细胞是直接效应细胞，其活性降低与Tregs的诱导产生、Th2细胞活性及数量的变化密切相关。

iTregs是在小剂量抗原或免疫抑制性细胞因子诱导下由外周幼稚T细胞发育而成，被认为在诱导OT过程中起着核心作用[14, 21-22]。OIT进程中，消化道摄取的食物致敏原可诱导GALS组织中Treg活化并分泌白介素-10(interlukin-10，IL-10)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)，以减少Th 2细胞产生细胞因子(如IL- 4、IL- 5、IL- 13)刺激B细胞产生特异性IgE，并诱导IgA、IgG 4等抗体分泌以拮抗IgE致敏作用。Treg同时可分泌多种抑制性分子，诸如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)和程序性死亡因子1(programmed cell death 1，PD-1)；CTLA4可使效应T细胞缺乏第二信使信号而发生免疫失能(T cell anergy)，PD-1可抑制T细胞的增殖及诱导细胞凋亡，从而促进免疫耐受的产生。在多个动物FA模型及临床研究中[17, 23]，随之致敏阈值的提高，OIT可导致IL-10、TGF分泌型iTreg与天然调节性T细胞(natural regulatory T cells, nTregs)的显著增加。但nTregs在OIT中的具体作用也存在争议。一项关于花生OIT的临床研究中显示，治疗组中受试者的iTregs数量及IL-10表达水平较干预前显著增加；而nTregs细胞数量在治疗、对照组中各观察时点无显著变化[24]。在OIT中，关于nTreg的具体作用及其与iTreg的相互关系仍需深入研究来阐释。此外，叉头样转录因子3(forkhead box protein 3，FoxP3)基因位点甲基化水平具有调控iTregs活性的作用[25]。研究表明，OIT受试者的SU状态与FoxP3低甲基化水平密切相关，iTregs表观遗传学变化可作为OIT疗效预测与评估的有效标记[24]。

新近研究表明，在FA进程中，Th2A细胞处于重要的核心地位[26]。Th2A细胞属于Th2亚群，分子表型为CD4+CRTh2+CD161+CD49d+CD27-CD45RB-。Th2A细胞只参与过敏反应，在非过敏个体中几乎不存在。OIT脱敏治疗成功后，受试者体内抗原特异性Th2A细胞大量减少[27]，这可能是OIT产生脱敏疗效的重要机制。Th2A可作为评估与预测OIT临床疗效的一个有效指标。后续深入研究Th2A产生及调控的机制，将大大有助于诱导长期稳定的SU。

基于既往大量研究[12, 28-30]，分析推测，对于FA患儿，在OIT的早期启动阶段，首次低剂量食物变应原暴露(摄入)可强化机体致病效应器反应，增强促炎细胞与B细胞的致病活性，刺激B细胞产生特异性IgE(IgE水平升高)；同时诱导抑制性环境以阻碍外周(肠道)Treg细胞的早期活化。随着OIT剂量的增加，持续的过敏原-IgE复合物、食物特异性Th2细胞刺激反应可触发反向免疫调节[31]。这些免疫变化又通过降低Th2A细胞活性，促进iTreg分化/生成以及调节IgE/IgG4比例变化(IgE水平降低，IgG4表达升高)，促使机体进入脱敏状态。此时，当干预中断或停止，OIT临床获益可能会显著降低。一旦达到特定的激活阈值并触发选择性的T细胞耗竭/清除-偏移效应反应，便进入OIT巩固期。在OIT维持期阶段，长时间、持续性过敏原刺激，可在Treg细胞分化进程中增强Foxp3位点的表观遗传修饰效应，这与SU的维持密切相关。需要注意的是，诱导建立OT的免疫学机制十分复杂，涉及众多免疫细胞(调节性B细胞、DC细胞、巨噬细胞、先天淋巴样细胞、骨髓衍生抑制细胞等)及各种细胞因子，肠道菌群结构其代谢产物，黏膜及组织上皮细胞屏障，抗原的理化性状、剂量及刺激的持续时间等各个方面。深入研究各因素在OT诱导过程中的具体作用，有利于建立安全高效、个体化OIT方案，为诱导长期耐受奠定基础。

3 OIT相关临床研究

目前大多数的OIT临床试验主要聚集于牛奶、鸡蛋、花生这3类常见的过敏原。

3.1 OIT在牛奶蛋白过敏中的应用

近10余年的随机对照研究显示出OIT对牛奶蛋白过敏患儿的治疗有效性和安全性[32]。Mori等[33]于2017年报道了一项随访长达10年的牛奶OIT队列研究。共有82例牛奶过敏儿童接受牛奶OIT并于1年后达到治疗终点，以对牛奶耐受程度为评价要点。研究显示58.1%患儿完全脱敏，可耐受100～150 mL牛奶；14.9%部分脱敏，可耐受2～50 mL牛奶；17.6%因出现胃肠道症状(占比46.1%)、急性哮喘(占比15.3%)、依从性差(占比23%)等因素而中断治疗。在后续5～10年随访中，完全脱敏者中绝大多数(约69.76%)可定期饮用牛奶；而在中断OIT受试者中，5～10年后仅有23. 07%达到部分脱敏、多数仍需规避牛奶饮食。表明OIT是治疗儿童牛奶蛋白过敏的有效手段，其中慢性胃肠炎症状是OIT中断的主要原因；而高水平牛奶特异性IgE、哮喘是诱导期OIT失败的危险因素。有学者发现，加热过程中的高温可使牛奶中的蛋白质分解、降低其致敏性，烘焙奶粉/牛奶更易被大多数FA患儿接受，此种暴露方式有助于促进最终对鲜牛奶的耐受[34]，但该方法仍存在争议。Goldberg等[35]将15例既往不能耐受鲜奶OIT的患儿(>4岁)纳入加热牛奶OIT方案进行观察研究，在医生监测下口服小剂量加热牛奶(180 ℃加热30 min)，拟每月增量50%，直至达到目标耐受量——1.3 g/d加热牛奶蛋白。结果仅有3例(21%)成功耐受目标剂量，余受试者则因为严重过敏反应退出研究。

3.2 OIT在鸡蛋过敏中的应用

2012年Burks等[36]首次发表了关于鸡蛋OIT的全美多中心、双盲、随机-安慰剂对照临床研究，研究共纳入55名蛋类过敏儿童(5～11岁)，其中40例接受OIT疗法，15例服用安慰剂(淀粉)。OIT方案以≤50 mg 生蛋清粉为初始量，每日25%递增、于10月内增加至目标维持量达2 g蛋清粉，随后以该剂量水平维持口服治疗22月。分阶段行3次OFC。结果显示，第10个月时OIT组中55%患儿通过了5 g蛋清粉OFC；于第22月时行10 g蛋清粉OFC，OIT组的成功率增加至75%，而安慰剂组均无人通过OFC。停用蛋清摄入4～6周后，即第24月时再次行10 g蛋清粉OFC，共有11例(28%，11/40)患儿成功通过并达到试验所认定的SU状态。随后多项双盲、随机对照临床试验显示[30, 37]，相对于安慰剂对照组，OIT可明显增强FA患儿对鸡蛋的耐受性，部分患儿可成功达到脱敏甚至SU状态。

3.3 OIT在花生过敏中的应用

花生过敏在西方国家较为常见。2014年Vickery等[38]发表了一项长达5年随访观察的花生OIT临床试验。研究初始纳入39例花生过敏儿童行OIT治疗；目标维持剂量为每天4 000 mg花生蛋白，治疗时长达(1 453±663)d，于OIT停止时点及随后1月行5 000 mg花生蛋白OFC以评价疗效。共有24例完成受试研究，其中50%(12例)成功通过OFC、提示治疗成功并达到SU状态，且部分受试者在5年后仍能通过OFC。这是首个长时程花生OIT后，受试者中有一半出现SU的研究报道。近期美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批准Aimmune Therapeutic生物制药公司的花生过敏免疫疗法-Palforzia[花生过敏原粉剂-dnfp， peanut(Arachis hypogaea)allergen powder-dnfp]临床试点应用[39]，这也是全球首个获批用于治疗花生过敏的OIT疗法。Palforzia由花生中提取的关键过敏原成分制备而成。治疗时将粉末从胶囊或小袋中取出，与少量半固体食物(如苹果酱、酸奶或布丁)混合并每天食用。前期的随机双盲试验(PALISADE Trial)中[40]，共计纳入496例4～17岁患有花生过敏症的儿童进行观察研究，372例接受了Palforzia治疗，通过20～40周剂量递增至维持剂量300 mg/d，对照组124例儿童予安慰剂治疗。随后，受试者按序依次接受挑战300、600、1 000 mg花生蛋白OFC。Palforzia组受试者的耐受率显著高于安慰剂组，分别达76.6%、67.2%、50.3%。常见不良反应为腹痛、呕吐、恶心、咳嗽、荨麻疹、皮肤瘙痒等，多发生于OIT增量期(发生率约9.4%)及维持剂量期(约8.7%)。目前Palforzia一年的治疗费用大约为10 680.5美元。

4 OIT的安全性

OIT常规临床应用前，其安全性与可耐受性仍是关注的焦点。多数不良(过敏)反应轻微且局限于口咽部不适、皮疹等症状，无需干预或单独使用抗组胺药。然而，需要注意的是，几乎所有的临床试验都出现过一个或数个严重的过敏反应。研究表明，过敏反应集中出现于初始快速剂量增加期与逐次增量阶段[41]，故此阶段的OIT干预建议于医生监督下完成。进入维持期，绝大多数受试者的耐受性良好，偶见多系统或严重不良反应。

某些因素可以降低受试者对OIT剂量的反应阈值。研究表明，在花生OIT试验期间，多种因素/模式与不良反应增加的可能性密切相关，包括并发疾病或月经，哮喘控制不佳，空腹干预治疗和干预后过度体力消耗[42]。因此，为提高OIT的安全性，试验方案需充分考虑上述影响因素并制定相应应对措施。另一方面，采用联合治疗策略或有助于减少OIT时的不良反应，加速免疫治疗的进程及提高远期疗效[43-44]。新近的一项Ⅱ期临床表明，对于花生过敏青少年，联合应用奥马珠单抗可有效减少OIT起始与增量阶段过程中重度/全身性过敏反应的发生[45]。其产生的原因可能与奥玛珠单抗降低嗜碱性粒细胞的致敏性及调节T细胞的极化方向(T-cell polarization)有关[46]。另一项多中心临床研究表明，在OIT起始阶段应用联合奥玛珠单抗，可使更多数(约83%)罹患严重牛奶蛋白过敏的患儿成功达到脱敏状态[47]。在花生/坚果过敏的小鼠模型中，与单独OIT干预相比，联合食物过敏中药配方2(food allergy herbal formula 2, FAHF-2，配方源自传统中药乌梅丸)可有效减少严重过敏反应的发生及提高免疫无应答状态的持久性[48]。目前，一项关于奥马珠单抗、B-FAHF-2与OIT多重联合治疗的Ⅱ期临床试验(ClinicalTrials. gov Identifier: NCT02879006)正在进行中，其结果或有助于更全面地评估联合治疗的作用。然而，关于OIT联合治疗的临床试验数量及规模仍有限，其长期有效性、安全性及其确切机制有待于更多的研究进一步证实。

此外，通过对大样本群OIT临床试验的安全/不良反应报告综合分析，结合对生物样本的联合组学分析，可揭示受试者的内表型并对其风险进行分层。这不仅有助于OIT在FA的治疗选择中给予准确的定位，还有助于开发更安全、个体化的OIT实施方案。

综上所述，目前OIT干预后受试者多是达到一种暂时的针对过敏原临床无反应状态(过敏阈值提高)，食用中断或停止时，脱敏保护作用则消失，达到SU状态多依赖于食物的定期持续摄入。OIT现仍处于临床试验阶段，其诱导长期耐受的能力、OIT干预的最佳时机、致敏抗原的最佳理化性状及剂量、联合治疗方案(如联用奥马珠单抗、中成药、益生菌、益生元等)的长期有效性及安全性、稳定SU状态是否需要更长期维持摄入及其干预频次等问题尚需大量研究解决。此外，对于SU及永久性耐受状态的评估与诊断仍缺乏统一、有效的标准，各中心定义不尽相同。因此，对FA及OT产生和维持机制的深入研究，OIT疗效评估、预测相关生物标记物的筛选，标准化方案制定及其评价体系的建立也将是今后研究的方向与重点。

当今全球与中国FA的患病率逐渐升高，现有研究表明OIT是极具前景的治疗FA的特异性新方法。OIT可改变FA自然进程，提高患儿生活质量。随着对OT机制的深入研究，通过OIT方式诱导、重塑机体免疫系统的特异性耐受不仅使FA患者受益，对抗移植排斥反应、自身免疫病及炎症性疾病的防治同样具有重要的实践意义，亦对深入研究“疾病耐受”提供了基础与思路。面对致敏原或“非我”抗原，是“和平共处”(持续无反应状态)还是“顽强抵抗”(过敏/炎性反应)，OIT有望成为协助机体处理好两者之间平衡的最好的临床“艺术”手段。