芽胞杆菌BvR001对大丽轮枝菌抑制效果研究

纪晓彬 王丹 刘政 李冉 宋健 张丹丹 陈捷胤 戴小枫 林克剑

摘要 ：為研发绿色、安全、高效的作物黄萎病生物防治产品，本研究以生防菌株BvR001为研究对象，通过对黄萎病菌的抑菌效果测定、可湿性粉剂研制、在寄主根际的定殖能力与防效测定，明确该菌株对黄萎病具有防控效果。gyrB序列检测和系统发育树构建分析表明，该菌株属于芽胞杆菌属，并且与贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis进化关系最近，推测其可能是贝莱斯芽胞杆菌;平板对峙试验表明，该菌对2种基因型（落叶型和非落叶型）大丽轮枝菌Vd991和D08047菌落扩展的抑制率分别为78.6%和85%;研发了该菌的可湿性粉剂配方（WPBvR001）：吸附量为1.2 L/kg的发酵液硅藻土母粉87%、十二烷基磺酸钠5%、木质素磺酸钠5%、羧甲基纤维素钠2%、维生素C 1%，该配方得到的制剂活芽胞量为7.65×108 cfu/g、润湿时间38 s、悬浮率为62.16%、杂菌率为0、pH 6.89±0.02、细度通过率（≤45 μm）99.99%、干燥减量0.67%;利用烟草和棉花测试发现，该菌剂对寄主植物安全无毒，且能有效定殖于寄主根际，显著降低了黄萎病菌繁殖扩展，对黄萎病具有良好的防效。

关键词 ：芽胞杆菌; 可湿性粉剂; 黄萎病; 生物防治

中图分类号：

S 476. 19文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019568

Inhibitory efficacy of BvR001 against Verticillium dahliae

JI Xiaobin1，3， WANG Dan2， LIU Zheng3， LI Ran2， SONG Jian2，

ZHANG Dandan2， CHEN Jieyin2， DAI Xiaofeng2， LIN Kejian1，2，3*

（1. College of Agriculture，Key Laboratory of Oasis Agricultural Pest Management and Plant Protection

Resources Utilization， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Shihezi University， Shihezi 832003， China;

2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China;

3. Institute of Plant Protection， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences， Shihezi 832000， China）

Abstract ：To develop safe and effective biological control measures for Verticillium wilt， a series of studies on strain BvR001 were conducted， including its taxonomic characterization， colonization of tobacco rhizosphere， its efficacy for controlling Verticillium wilt and development of a wettable powder （WPBvR001） formulation to facilitate field application of the product. These studies confirmed that BvR001 could control Verticillium wilt on host plants such as cotton and tobacco. Gyrase B subunit gene gyrB sequence and the phylogenetic analyses showed that this strain was most closely related to Bacillus velezensis. Coinoculation of BvR001 and two strains of Verticillium dahliae （defoliating strain Vd991 and nondefoliating strain D08047） on media separately showed 78.6% and 85% inhibition of V.dahliae， respectively. The product WPBvR001 displayed no phytotoxicity， colonized the plant rhizosphere efficiently， and resulted in significant reduction in the wilt incidence and severity on tobacco and cotton. Optimization of the biocontrol formulation of strain BvR001 was accomplished by mixing diatomaceousearth 87%， sodium dodecyl sulfate （SDS） 5%， sodium lignosulfonate 5%，

carboxymethyl cellulose sodium 2%， and vitamin C 1%. The product WPBvR001 contained dehydrated 7.65×108 cfu/g of BvR001 with 99.9% viability and 0 other microorganisms， fineness pass （≤45 μm）， wetting time of 38 s， suspension rate of 62.16%， dry decrement of 0.67%， and a pH of 6.89±0.02. Our study demonstrated that the biocontrol strain BvR001 is a valuable new product for the Verticillium wilt management in crops.

Key words ：Bacillus spp.; wettable powder; Verticillium wilt; biological control

黄萎病是由大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.引起的典型土传维管束真菌病害，严重威胁农作物生产安全。大丽轮枝菌寄主范围十分广泛，在我国自然病圃和人工病圃中大丽轮枝菌可感染38科600多种植物，除棉花外，茄科、豆科、葫芦科、菊科、唇形科和苋科等科的多种植物亦可受害[12]，每年给农业生产带来巨大损失。黄萎病对棉花生产造成的危害尤为严重，是棉花生产上的头号病害，受害棉株叶片变黄枯萎，蕾铃脱落，棉铃变少，一般减产20%左右，重者达60%以上[3]。化学农药是防控黄萎病的有效方法之一，但化学药剂防治存在环境污染、残留、病原抗药性等问题，因此开发人畜无害、对环境友好的微生物制剂对黄萎病防控具有重要意义。

目前，已发现多种生防菌对大丽轮枝菌具有良好的抑制作用，如特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis XT14对马铃薯黄萎病的防效可达到60%以上[4];室内防效试验显示，多黏类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa SX3能够延迟病害的发生，同时对棉花具有一定的促生作用[5];解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens PHODB35对作物黄萎病具有良好的防效[6]。还有一些内生真菌对大丽轮枝菌具有拮抗作用，研究较多的是木霉属，如哈茨木霉Trichoderma harzianum、绿色木霉T.viride、棘孢木霉T.asperellum等均能够有效防治黄萎病菌对番茄、橄榄等的危害，并伴有促生作用[78]。此外，有研究发现，一些非致病性镰刀菌对大丽轮枝菌有一定的抑制作用，比如尖镰孢Fusarium oxysporum F2能够在茄子根茎有效定殖，并能减少大丽轮枝菌在根部的定殖，从而减轻黄萎病的发生[9]。目前也有一些生防菌制备成可湿性粉剂被应用于生产实践，如芽胞杆菌Paenibacillus alvei K165的生防制剂拌土后能有效降低茄子黄萎病的发病症状[10];枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis在棉花、向日葵等作物黄萎病的防控上也取得了显著的效果[1112]。此外，有研究表明，由于自然环境的多样性及复杂性，多种生防菌按一定比例混合使用，能够起到比单独使用一种生防菌更好的效果[1314]，如特基拉芽胞杆菌C9和鞘氨醇杆菌Sphingobacterium A1复配使用不仅能够高效抑制黄萎病菌的生长，还能激活寄主植物的防御反应，从而显著提高寄主棉花对大丽轮枝菌的抗性[15]。

我国黄萎病危害尤为严重，特别是近年农业种植结构调整加剧了黄萎病病原的变异，亟须筛选新的对黄萎病具有防控效果的生防菌株并进行防控效果评价，为最终在生产上防控黄萎病提供理论和数据支撑。为此，本研究以分离自棉花、可显著抑制大丽轮枝菌生长的生防菌株BvR001为研究对象，通过对不同基因型（落叶型和非落叶型）大丽轮枝菌的抑菌效果测定、可湿性粉剂的制备以及制剂对烟草和棉花黄萎病的抑制效果测定等试验，评价该菌株制剂对黄萎病的防效，为该菌剂后期配方优化及在黄萎病防治中的推广应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌株：供试的大丽轮枝菌包括两种基因型，分别为强致病力落叶型Vd991（本实验室保存）和中等致病力非落叶型D08047（来自中国农业科学院棉花研究所）。芽胞杆菌BvR001分离自新疆黄萎病棉田生长正常的棉株。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、LB（LuriaBertani）培养基。

试剂：硅藻土（中位粒径22.2 μm）、十二烷基磺酸钠、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠、维生素C、植物DNA快速提取试剂盒EASYspin（原平皓，北京）、TransStart Top Green qPCR SuperMix（全式金，北京）。

主要仪器：鼓风式干燥机、气流粉碎机。

供试寄主植物：烟草Nicotiana benthamiana，棉花Gossypium hirsutum 品种为‘军棉1号，均选取长势一致、状态良好、生长3周的幼苗作为测试对象。

1.2 微生物培養

将-80℃保存的BvR001划线于LB固体培养基上，37℃培养活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃、180 r/min过夜培养作为种子液，再以1%的接种量转接于新鲜的LB液体培养基中，37℃、180 r/min条件下培养48 h得到发酵液。

分别取3 μL保存于-80℃的大丽轮枝菌Vd991和D08047，接种于PDA固体培养基上，25℃恒温培养3～7 d，挑取菌落接种于完全液体培养基（complete medium， 酵母提取物6 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，蔗糖10 g/L）中，25℃、150 r/min培养5～7 d，过滤收集孢子，并将孢子浓度调至107个/mL备用。

1.3 菌株BvR001分子鉴定

通过PCR扩增gyrB（DNA gyrase subunit B gene）基因序列[16]。扩增引物序列如下：

UP1：5′GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA（C/T）GC（A/G/C/T）GG（A/G/C/T）AA（A/G）TT（C/T）GA3′;UP2R：5′AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC（A/G）TC（A/G/C/T）AC（A/G）TC（A/G/C/T）GC（A/G）TC（A/G/C/T）GTCAT3′。

扩增体系为30 μL：DNA模板1 μL，gyrB基因序列通用简并引物各1 μL，2×PCR Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。扩增条件：95℃预变性5 min;94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30次循环;最后72℃延伸10 min。

1.4 菌株BvR001抑菌活性测定

采用5 mm打孔器打取大丽轮枝菌Vd991和D08047菌饼，置于90 mm的PDA平板中心，28℃恒温培养5 d。在距离菌落边缘15 mm处接种芽胞杆菌BvR001，于28℃恒温继续培养7 d，观察菌落生长情况，测量大丽轮枝菌菌落直径以及生防菌菌落边缘与大丽轮枝菌菌落边缘的垂直距离，即抑菌带距离，计算生防菌BvR001对Vd991和D08047菌落扩展的抑制率。计算公式如下：

抑菌率=抑菌带距离/（12 d对照菌落半径-5 d对照菌落半径）×100%。

1.5 生防菌BvR001可湿性粉剂制备

将种子液以1%的量加入新鲜LB液体培养基中，37℃、180 r/min条件下培养48 h得到发酵液。向1 kg载体硅藻土中添加BvR001发酵液，直至硅藻土完全湿润不再吸附，将得到的混合物鼓风干燥后经气流粉碎，得到吸附量为1.2 L/kg的母粉。向母粉中添加不同比例的润湿剂（十二烷基磺酸钠、木质素磺酸钠）、分散剂（羧甲基纤维素钠）等助剂混匀后经气流粉碎机粉碎，得到可湿性粉剂（wettable powder）WPBvR001。

1.6 可湿性粉剂质量检测

制剂中活芽胞含量参照NY/T 2293.12012[17]中描述的方法，润湿时间参照国标GB/T 54512001[18]中的方法测定，悬浮率参照国标GB/T 148252006[19]中的方法测定，杂菌率参照NY/T2293.12012[17]中的方法测定，pH值按国标GB/T16011993[20]中的方法测定，细度按国标GB/T 161501995[21]中的方法测定，干燥减量参照NY/T2293.12012[17]中的方法测定。

1.7 可湿性粉剂活性测定

称取1 g BvR001可湿性粉剂WPBvR001溶于100 mL无菌水中，混匀配制成粉剂悬液备用，同时以商业化芽胞杆菌可湿性粉剂WPBS1作为对照。选取长势一致的健康烟草幼苗以及棉花幼苗若干，均分成6组，每组200 mL悬液，处理1接种浓度为107个/mL的Vd991孢子悬浮液;处理2先浇灌商业化可湿性粉剂WPBS1悬液，7 d后再次接种107个/mL的Vd991孢子悬浮液;处理3只浇灌商业化可湿性粉剂WPBS1悬液，作为处理2的对照;处理4为先浇灌可湿性粉剂WPBvR001，7 d后再次接种107个/mL的Vd991孢子悬浮液;处理5只浇灌可湿性粉剂WPBvR001悬液，作为处理4的对照;剩余一组作为空白对照（Mock），只定期浇水。接种15 d后进行病情观察。使用苗期 5 级分级法进行调查，0级：植株未表现出黄萎病症状;1级：1～2片子叶出现轻微黄萎病症状;2级：1片真叶出现轻微黄萎病病症;3级：2片及以上真叶出现明显病症;4级整株出现严重黄萎病病症或枯死。

病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100。

1.8 烟草和棉花茎基部大丽轮枝菌定殖检测

分别取各处理烟草、棉花的茎基部（根茎结合部位），表面清洗干净后剪碎混匀，液氮速冻后保存于-80℃备用。各处理取100 mg的根茎结合部组织并提取基因组DNA，将各样品DNA浓度调至100 ng/μL，分别以烟草NbEF1α、棉花管家基因18S为内参基因，大丽轮枝菌的延伸因子VdEF1α作为靶标基因，通过定量PCR（qPCR）检测大丽轮枝菌靶标基因VdEF1α的相对值，即大丽轮枝菌的相对含量。定量引物序列见表1。

反应体系20 μL：DNA模板1 μL，引物各0.6 μL，2×qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 7.8 μL。

1.9 烟草根部生防菌BvR001的测定

以烟草根际生防菌定殖检测为例，分别取各处理烟草的根部，表面消毒后剪碎混匀，分别称取1 g各处理的根部组织，加10 mL无菌水研磨，滤掉植物碎渣，取上清液进行梯度稀释涂板，次日统计BvR001菌落数。

1.10 数据处理

应用MEGA 6构建系统发育树[22]，采用SPSS 23软件对试验数据进行方差分析，采用Microsoft Excel 2016及Adobe Photoshop CC作图。

2 结果与分析

2.1 菌株BvR001的gyrB序列分析

通过PCR扩增获得BvR001的gyrB基因序列长度为1 139 bp，将该序列在NCBI进行BLAST比对，结果显示其与贝莱斯芽胞杆菌B.velezensis BH21（GenBank： KT889364）的gyrB序列一致性達99%。选取大肠杆菌Escherichia coli ATCC11775的gyrB基因序列（GenBank：AB083821）为外群，利用MEGA 6软件，采用邻接法（neighborjoining）构建系统发育树。结果表明，菌株BvR001与贝莱斯芽胞杆菌聚在一个分支（图1），以上结果表明，该生防菌株属于芽胞杆菌属，并且与贝莱斯芽胞杆菌进化关系最近，推测其可能是贝莱斯芽胞杆菌。

2.2 菌株BvR001抑菌活性测定

平板抑菌结果表明，BvR001对2种基因型大丽轮枝菌（强致病力落叶型Vd991和中等致病力非落叶型D08047）的菌落扩展均有显著的抑制作用（图2a）。进一步通过测量抑菌带距离，统计结果发现，BvR001对大丽轮枝菌有显著的抑制作用（P<0.01）（图2b），计算得到生防菌BvR001对Vd991和D08047菌落扩展的抑制率分别可达78.6%和85%。

2.3 可湿性粉剂制备及质量检测

对添加不同比例的十二烷基磺酸钠、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠及维生素C的母粉的润湿性及悬浮率进行测定，结果表明，芽胞杆菌BvR001可湿性粉剂（WPBvR001）优化制备方法为：向载体硅藻土中添加摇瓶发酵液直至硅藻土完全湿润不再吸附，将得到的混合物鼓风干燥后经气流粉碎得到母粉，再加入助剂十二烷基磺酸钠5%、木质素磺酸钠5%、羧甲基纤维素钠2%以及紫外保护剂维生素C 1%，经气流粉碎机混合均匀。该配方得到的制剂活芽胞量为7.65×108 cfu/g，润湿时间38 s，悬浮率为62.16%，杂菌率为0，pH值为6.89±0.02，细度通过率（≤45 μm）99.99%，干燥减量0.67%（表2）。

2.4 可湿性粉剂活性测定

以烟草和棉花为测试对象对可湿性粉剂WPBvR001对黄萎病的防效进行测定。结果显示，单独接种Vd991的处理组烟草植株弱小，株高增长缓慢或停滞，叶片发黄枯萎至死亡，茎基部剖面图显示茎基部维管束褐化，呈现出典型的黄萎病症状;生防菌剂WPBvR001+Vd991及商业化生防菌剂WPBS1+Vd991两组处理下烟草的长势良好，和空白对照组基本一致，表现出良好的黄萎病防控效果;单独接种生防菌剂WPBvR001的烟草长势正常，茎基部维管束未见褐化（图3a和3b）。对棉花黄萎病的防效也得到类似结果，与商业化生防菌剂WPBS1相似，可湿性粉剂WPBvR001预处理的棉花幼苗对大丽轮枝菌表现出良好抗性，叶片黄化脱落明显减轻，维管束褐化得到缓解（图3c和3d），说明WPBvR001对黄萎病的防效与商业化菌剂WPBS1相当。

对不同处理条件下烟草和棉花的发病情况进行统计，结果显示，生防菌剂WPBvR001+Vd991及商业化生防菌剂WPBS1+Vd991两组处理下烟草和棉花的病情指数与单独接种Vd991相比，具有显著性差异（P<0.05），进一步说明生防菌剂WPBvR001对黄萎病具有良好的防效（表3）。

2.5 烟草和棉花茎基部大丽轮枝菌定殖检测

采用qPCR检测大丽轮枝菌Vd991靶基因Verticillium elongation factor 1α（EF1α）在烟草和棉花茎基部的相对拷贝数，并以此表示大丽轮枝菌在寄主根部的生物量[24]，进一步明确可湿性粉剂WPBvR001对黄萎病的防效。结果表明，单独接种大丽轮枝菌Vd991的烟草茎基部中Vd991的生物量显著高于同时接种生防菌剂（WPBS1和WPBvR001）和大丽轮枝菌的试验组（α=0.01），其中单独接种Vd991的烟草茎基部菌体生物量分别是经商业化生防菌剂WPBS1和本试验可湿性粉剂WPBvR001处理后的14倍和25倍（图4）。对棉花的测试结果类似，单独接种Vd991的棉花茎基部的生物量显著高于WPBS1+Vd991以及WPBvR001+Vd991处理的棉花（α=0.01），分别为7倍和4倍（图4）。上述结果说明可湿性粉剂WPBvR001能够有效防止大丽轮枝菌在烟草和棉花茎基部的定殖，进而达到防控黄萎病的作用。同时，上述结果也显示可湿性粉剂WPBvR001对烟草和棉花黄萎病具有和商业化生防菌剂WPBS1相当的防效。

2.6 烟草与棉花根部组织生防菌BvR001定殖检测

以烟草与棉花为例对生防菌BvR001在根部定殖情况进行检测，通过稀释涂板法，统计不同处理烟草和棉花根部组织内生防菌BvR001定殖情况。结果显示，与商业化生防菌剂WPBS1类似，单独接种可湿性粉剂WPBvR001和既接种可湿性粉剂WPBvR001又接种病原菌的处理，烟草和棉花根部内生的生防菌菌落数没有明显差异，菌落数均在105 cfu/g左右，随机挑选平板中菌落进行测序分析，结果显示测序菌落均为生防菌BvR001，这一结果表明可湿性粉剂WPBvR001能够有效定殖于烟草和棉花根系，并且病原菌对生防菌的定殖也没有显著影响（图5）。

3 讨论

芽胞杆菌属的不同种之间亲缘关系极为相近，16S rDNA序列很难区分，比如苏云金杆菌Bacillus thuringiensis和蜡样芽胞杆菌B.cereus的16S rDNA序列僅有几个碱基的差异[23]，而gyrB基因进化速率快且不发生水平转移，有较好的分辨率[25]。本试验利用该基因序列对芽胞杆菌BvR001进行分类鉴定，可初步将其与其他芽胞杆菌区分开，通过系统发育树分析推断本研究的芽胞杆菌BvR001为贝莱斯芽胞杆菌。关于该菌株准确的种属分类尚需进一步的分子验证。

本研究还通过平板对峙试验检测了BvR001对不同基因型大丽轮枝菌Vd991和D08047菌落生长的抑制效果，结果表明BvR001具有潜在的防控黄萎病应用价值。可湿性粉剂是微生物农药中的主要剂型，该剂型生产成本低，应用范围广。有研究表明在可湿性粉剂研制过程中气流粉碎的方法对活芽胞含量的影响十分微小，增加粉剂细度则更有利于吸收粉剂，大大缩短润湿时间，提高悬浮率[26]。本试验也采取气流粉碎方法对各组分进行混合，最终制剂细度为99.99%，几乎完全通过45 μm筛选筛，润湿时间也大大缩短。初步得到的生防菌剂WPBvR001的活芽胞数为7.65×108 cfu/g。后续研究为了在实际应用中达到低剂量、高防效的目的，还需进一步提高制剂活芽胞数，例如可以对BvR001菌株发酵条件进行优化，筛选该菌株最佳发酵条件。如研制生防菌B991可湿性粉剂时首先对其发酵条件进行了优化，通过筛选得到菌量为100亿芽胞杆菌cfu/mL的菌量[27]，为后期得到更多生物量的生防菌剂提供了基础保障。对WPBvR001各项指标进行测定发现，除悬浮率偏低外（悬浮率为62.16%，低于国标值≥70%），其余各指标均符合国标值。针对悬浮率不足问题，后期应进一步选择多种助剂进行筛选，尤其是对分散剂的选择。

本研究以烟草及棉花幼苗为测试植物，对初步得到的可湿性粉剂WPBvR001对黄萎病的防效进行了测定，单独接种生防菌剂WPBvR001的烟草和棉花均能正常生长，茎基部维管束未见褐化，说明该生防菌对植物安全无毒，为进一步确定其对人畜也安全无毒，后期还需进一步通过一系列毒理学试验来确保其安全性，比如急性经口、急性经皮毒性试验，急性皮肤刺激试验等。单独接种Vd991的处理组烟草和棉花幼苗的植株弱小，株高增长缓慢或停滞，叶片发黄枯萎至死亡，茎基部维管束褐化，而接种生防菌剂WPBvR001+Vd991及商业化的生防菌剂WPBS1+Vd991两组处理下烟草和棉花的长势良好，和空白对照组基本一致，说明WPBvR001对室内烟草和棉花黄萎病的发生具有良好的防效，且效果与商业化菌剂WPBS1相当。同时，经生防菌剂处理的烟草和棉花的根茎结合部位组织仅能检测到少量的大丽轮枝菌，对接种WPBvR001的烟草根际生防菌的检测发现，生防菌能够在根际有效定殖，并且不受后来入侵的病原菌大丽轮枝菌制约，说明BvR001菌株具有良好的生防应用前景。

[20]中华人民共和国化学工业部. GB/T 1601-1993农药pH值测定方法[S]. 北京： 中国标准出版社， 1993.

[21]中华人民共和国国家化学工业部. GB/T 16150-1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法[S]. 北京： 中国标准出版社， 1995.

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（责任编辑：田 喆）