UPLC-MS/MS同时检测蔬菜中三种杀菌剂残留的研究

黄丽, 邓毅书, 浦恩堂, 代雪芳, 李文希

(1.云南农业大学资源与环境学院, 昆明 650201; 2.云南省农业科学院农业环境资源研究所, 昆明 650205)

蔬菜中的农药残留是一个社会热点问题，农药残留不仅对人体健康和环境带来潜在危害，引发社会对食品安全的恐慌，还对我国的农产品出口贸易产生极大影响[1]，因此食品中的农药检测显得尤其重要。烯酰吗啉(dimethomorph)是一种羧酸酰胺类真菌杀菌剂，化学式为C21H22ClNO4；霜脲氰(cymoxanil)是一种脲类杀菌剂，化学式为 C7H10N4O3；唑嘧菌胺(ametoctradin)是一种三唑嘧啶类杀菌剂，化学式为C15H25N5。这三种杀菌剂主要用于防治卵菌病害，对马铃薯、番茄、茄子等蔬菜的卵菌病害具有优良的治疗作用，因此广泛应用于蔬菜晚疫病、霜霉病等疾病的防治。

目前，烯酰吗啉的检测方法主要有气相色谱法(GC)[2-3]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)[4-5]、高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS)[6]，霜脲氰的检测方法主要有高效液相色谱法(UPLC)[7-8]，唑嘧菌胺的检测方法有超高效液相色谱法(UPLC)[9]，这些方法大多前处理条件复杂，净化条件苛刻，耗时长且成本高。并且，因烯酰吗啉、霜脲氰、唑嘧菌胺复配使用能减少抗性，通常以复配的形式在蔬菜中使用，所以单一农药检测方法已经不能满足快速检测要求，而食品中农药最大残留限量(GB 2763—2019)[10]中也没有规定唑嘧菌胺的标准检测方法。本研究基于 UPLC-MS/MS技术，旨在优化前处理技术，建立一种能同时快速检测蔬菜基质中烯酰吗啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的分析方法，为其快速检测提供技术支持。经研究证明，该方法准确度、灵敏度、精密度均符合农药残留试验准测(NY/T 788—2018)[11]的要求。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试样品：选取当地市场售卖的马铃薯、茄子、萝卜和西红柿为代表性蔬菜，取可食部分用破壁机打碎。

仪器：Waters Xevo TQD三重四极杆液质联用仪(Waters公司)；AE100电子分析天平(梅特勒公司)；PL620-S电子天平(梅特勒公司)；TARGIN VXIII多管涡旋振荡仪；LXJ-IIB 低速大容量多管离心机(上海飞鸽)；1-14台式小型离心机(希格玛公司)；破壁机(沃健佳)。

试剂：纯度96.2%的烯酰吗啉标准品(常隆公司)；纯度99.9%的霜脲氰标准品(Dr公司)；纯度99.7%的唑嘧菌胺标准品(Dr公司)；色谱纯甲醇、乙腈(Merck公司)；优级纯甲酸(安普公司)；分析纯MgSO4、NaCl(国药公司)；C18、N-丙基乙二胺(PSA)(上海斯信生物科技公司)、石墨化碳(Agilent公司)、蒸馏水(屈臣氏)。

1.2 溶液配制

标准储备液：准确称取烯酰吗啉标准品0.010 4 g，乙腈定容至10 mL，配制浓度为1 000 μg·mL-1的标准储备液；准确称取霜脲氰标准品0.010 0 g，乙腈定容至10 mL，配制浓度为1 000 μg·mL-1的标准储备液；准确称取唑嘧菌胺标准品0.010 1 g，乙腈定容至10 mL，配制浓度为1 007 μg·mL-1的标准储备液，5 ℃避光保存。

混合标准溶液：准确吸取上述各储备液1 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成100.0 μg·mL-1的混合标准储备液，然后按照此方法逐步稀释为10.0、1.0、0.1 μg·mL-1的混合标准工作液，4 ℃下保存。

溶剂标准工作液：分别移取900 μL乙腈于2 mL离心管中，再移取100 μL的10 μg·mL-1混合标准溶液于2 mL离心管中，后用乙腈逐级稀释为1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg·mL-1的溶剂标准工作液。

基质匹配标准工作液：分别移取900 μL空白基质净化液于2 mL离心管中，再移取100 μL的10 μg·mL-1混合标准溶液于2 mL离心管中，后用空白基质净化液逐级稀释成1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg·mL-1的溶剂标准工作液。

1.3 试验方法

1.3.1试验设计 以添加回收率为指标，添加回收率越接近100%，效果最好[11]。设置乙腈(A1)、1∶1的乙腈-0.1%甲酸水(A2)、1∶1的乙腈-水(A3)、甲醇(A4)共4种不同提取剂，以及5 g NaCl(B1)、2.5 g NaCl+2 g MgSO4(B2)、5 g MgSO4(B3)、4 g NaCl+1 g MgSO4(B4)、4.5 g NaCl+0.5 g MgSO4(B5)共5种不同配比的盐析材料，考察不同提取剂和不同盐析材料的提取效率。设置C18+GCB(C1)、C18(C2)、C18+PSA(C3)、GCB+PSA(C4)、PSA(C5)、GCB(C6)、C18+PSA+GCB(C7)共7种组合净化剂，比较分析不同净化剂的净化效率。综合提取剂、盐析材料和净化剂的最佳组合，在空白样品中添加了0.005、0.05、0.5、1.0 mg·kg-14个浓度的混合农药溶液，做5次平行回收试验，以标准曲线定量，通过考察烯酰吗啉、霜脲氰和唑嘧菌胺在蔬菜基质中的线性方程、相关系数、准确度、精密度、检出限和基质效应对所建立的方法进行验证。

采用相对响应值法对基质产生的基质效应(matrix effect，ME)做出评价。基质效应计算公式如下。

ME=B/A×100%

式中，B指目标物在标准溶液中的峰面积之和，A指目标物在基质匹配标准溶液中的峰面积之和。

ME>100%，表现为基质增强效应；ME<100%，表现为基质抑制效应；80%

1.3.2样品处理 称取5.0 g打碎样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，振荡提取5 min，加入4 g NaCl+1 g MgSO4，振荡1 min，3 000 r·min-1离心5 min。取上清液1 mL于装有50 mg C18的2 mL的离心管中，涡旋混匀3 min，14 700 r·min-1离心3 min。取上清液，过0.22 μm滤膜，UPLC-MS/MS进样分析。

1.3.3UPLC-MS/MS检测条件 色谱分析条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱，柱温40 ℃，样品室温度为室温，进样体积为1 μL，流速为0.4 mL·min-1，流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：甲醇。梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

质谱分析条件：质谱电子轰击离子源为ESI，正离子模式(ES+)扫描，多反应监测模式(MRM)进行数据扫描；离子源温度为150 ℃；脱溶剂气流速温度为350 ℃；脱溶剂气流速800 L·h-1；毛细管电压2.9 kV；锥孔气速50 L·h-1，通过对毛细管电压、碰撞能等质谱参数的最佳优化，最终确定烯酰吗啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定性和定量离子对及对应质谱条件(表2)。

表2 3种农药MRM模式下的检测条件

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择和优化

2.1.1提取溶剂的选择 从不同提取溶剂的回收率(图1)可以看出，当提取溶剂为乙腈(A1)时，3种化合物的回收率在92.7%～102%之间，由于乙腈的极性范围广，对样品基质有较强的渗透作用，提取的色素杂质少，有助于后期的盐析和净化。提取溶剂为0.1%甲酸水-乙腈(A2)和乙腈-水(A3)时，烯酰吗啉和霜脲氰两种目标物的提取效率大于260%，大大超出了回收率的限值，可能是因为水的极性范围广，提取目标物的过程中也能提取到一些其他杂质，对仪器分析带来干扰，最终影响目标化合物的定性和定量。采用甲醇(A4)作为提取溶剂时，其回收率为62%～72%，回收率太低。因此，选取乙腈为3种混合农药的提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对3种杀菌剂的提取效率

2.1.2盐析材料的选择 在盐析辅助均相液相萃取中最常用的盐是NaCl和MgSO4。但因Mg2+的离子电位高，水相的离子强度大，而NaCl与目标物存在相互作用，常常影响萃取效率[13]。因此，本研究比较了不同配比盐析材料的除水效果，不同处理的回收率结果见图2，可见，当使用5 g NaCl(B1)作为盐析材料时，烯酰吗啉的回收率可达到110%，当使用5 g MgSO4(B3)作为盐析材料时，霜脲氰的回收率可达到128%，偏高；当使用2.5 g NaCl+ 2.5 g MgSO4(B2)作为盐析材料时，唑嘧菌胺的回收率偏低，仅有81%。综合三种目标物的回收率，最终选取4 g NaCl+1 g MgSO4(B4)作为盐析材料。

图2 不同盐析材料对农药回收率的影响

2.1.3净化剂的选择 快速、简单、便宜、有效、可靠和安全等特点已成为现在国际上主要的净化技术研究方向，吸附材料主要是通过离子相互作用、非极性相互作用、极性相互作用等选择性地去除和保留基质中的干扰成分，从而实现净化的目的[12]。不同净化剂的回收率结果见图3，可见，当采用PSA(C5)作为净化剂时，烯酰吗啉的回收率偏高，但采用GCB(C6)作为净化剂时，烯酰吗啉和霜脲氰的回收率均太低，只有采用C18(C2)作为净化剂时，3种目标化合物的回收率均在96.4%～101%之间，达到最理想的效果。因此，本研究最终选取C18作为最终的净化材料。

图3 不同净化剂对目标物回收率的影响

2.2 基质效应的评价

基质效应(ME)是指提取基质中的目标物时，基质中的干扰物影响目标化合物的离子化，使得目标化合物在仪器上的响应发生了增强或者抑制的现象。为提高目标化合物的测定准确度，需要对不同基质产生的基质效应做出评价，并选择合适的方法减小基质效应的干扰[14]。对3种药剂在蔬菜中的基质效应进行评价，结果(表3)显示，基质效应在94.22%～108.74%范围内[12]，因此该基质效应可忽略。

2.3 方法学验证

2.3.1线性关系和定量限 以质量浓度为横坐标(x)，定量离子的峰面积为纵坐标(y)，进行回归分析。3种目标物在不同基质中的线性方程、相关系数、线性范围和定量限结果见表3，可见，在0.001～1.0 μg·mL-1范围内，3种目标化合物在不同基质中的相关系数r均大于0.999 0，线性关系良好，说明在该测定条件下3种农药检测结果是可信的。取信噪比S/N=10确定定量限，烯酰吗啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定量限均为0.005 mg·kg-1。

表3 3种目标物的基质效应、线性关系和定量限

2.3.2回收率和精密度 添加不同分析物浓度的马铃薯、西红柿、茄子和萝卜测得的回收率结果见表4。可见，烯酰吗啉在蔬菜中的平均加标回收率为87.3%～105.7%，相对标准偏差为1.5%～11.0%；霜脲氰在蔬菜中的平均加标回收率为85.4%～113.4%，相对标准偏差为0.5%～10.9%；唑嘧菌胺在蔬菜中的平均添加回收率为80.9%～108.4%，相对标准偏差为2.8%～10.2%。结果表明，该方法的准确度和精密度均符合农药残留分析要求[11]。

表4 3种目标物在蔬菜基质中的添加回收率均值和相对标准偏差

3 讨论

本研究通过超高液相色谱分离和串联质谱检测方法，优化了提取剂、盐析材料和吸附剂的组合，简化了前处理步骤，降低了样品基质的干扰，保证了分析结果的准确性。结果表明，样品经乙腈提取，十八烷基硅烷(C18)分散固相萃取净化，HSS T3色谱柱分离待测物，甲醇-0.1%甲酸水为流动相梯度洗脱，正负离子分段扫描和多反应检测模式(MRM)检测，基质匹配标准溶液外标法定量，其精密度、准确度和灵敏度均符合农药残留分析要求。

通过取10倍信噪比来确定定量限，烯酰吗啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定量限均为0.005 mg·kg-1，根据中国《食品中农药最大残留限量》(GB2763—2019)[10]标准，烯酰吗啉在蔬菜类中的最大残留限量(MRL)值最小为0.05 mg·kg-1，霜脲氰在蔬菜类中的MRL值最小为0.2 mg·kg-1，唑嘧菌胺在蔬菜类中的MRL值最小为0.05 mg·kg-1。因此，该方法的灵敏度能满足烯酰吗啉、霜脲氰和唑嘧菌胺检测需要。

该方法具有基质干扰小、高通量、萃取效率高、操作简单、分析快、溶剂用量少、成本低等优点，满足农残检测分析中高效率、高通量、低成本的要求，能为蔬菜中烯酰吗啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的消减动态和最终残留研究提供方法保证，对维护食品安全具有重要意义。对于一些复杂基质，本研究所采取的净化剂的净化效果和适用性仍然可能有一些局限性，可能需要对前处理条件进一步优化以获得更好的结果。试验过程中发现盐析材料NaCl和MgSO4的配比对回收率的影响较大，但其具体影响原理和最佳配比规律需进一步探讨。