盐爪爪根际耐盐促生菌的筛选及穴栽验证

张志东, 顾美英, 唐琦勇, 楚敏, 朱静, 孙建, 杨蓉, 徐万里

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所, 新疆特殊环境微生物实验室, 乌鲁木齐 830091;2.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所, 乌鲁木齐 830091)

新疆盐碱土地分布广，盐碱化种类多样，被称为世界盐碱土的博物馆[1]。同时，由于长期耕作管理不当，以及当前膜下滴灌模式的采用，近50% 宜耕土地受不同程度盐渍化和次生盐渍化的威胁，严重影响了作物生长发育及产量。如何利用新技术、新方法有效减缓盐渍化对农业作物的影响，推动新疆农业高效可持续发展，已成为科研工作者亟待解决的重大课题[2-3]。

植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobateria, PGPR)是指生存在植物根际或根表，直接或间接促进或调节植物生长的一类微生物菌群[4]。相关研究表明，根际细菌在共同适应和进化过程中，能够通过多种机制促进植物生长，一方面可通过产生植物生长调节剂来直接促进作物生长，也可以通过其固氮、溶磷、解钾的作用转化土壤中矿物质，以促进植物相关营养元素的吸收利用[4-7]；另一方面，根际细菌也可通过产生抗菌物质、诱导作物产生系统抗性，以增强植物的抗逆特性[8-9]。同时，PGPR代谢活动能够增强土壤中有机物的分解，促进植物营养元素的矿化，改良土壤结构和营养成分，提高土壤肥力[10-12]。国内外相关学者已对多种农作物如烟草、棉花、花生等开展植物根际促生细菌研究，结果表明，PGPR在农作物防病、增产中具有重要作用[12-15]。同时，在荒漠耐盐植物根际耐盐促生菌方面也有研究[13]，为利用相关菌株提高农作物耐盐性、促生长、开发相关菌剂提供了理论依据。

新疆地区盐生植物种类多、分布广，其中藜科多年生灌木盐爪爪[Kalidiumfoliatum(Pall.)Moq]是典型的盐生植物，广泛分布在盐碱荒漠生境，具有较强抗逆特性。前期研究表明，盐爪爪根际存在丰富的耐盐微生物，部分菌株具有产生吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)和解磷等植物促生作用[14]。因此，进一步开展盐爪爪根际微生物耐盐促生菌的研究，将有利于相关微生物菌肥的研制，进而为新疆盐渍土地的治理开发提供新技术和新方法。本研究以盐爪爪根际微生物为研究对象，开展了其耐盐促生细菌的分离鉴定及促生特性分析，并进行了棉花盆栽效果验证试验，旨在为进一步筛选和复配耐盐促生菌肥提供科学依据和前期基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试植物 盐爪爪于2016年4月采自新疆和硕地区。供试棉种为陆地棉新陆中42号，购自新疆明珠花卉市场。

1.1.2培养基 解磷基础培养基(NBRIP培养基)、Ashby培养基、硅酸盐细菌培养基、Pikovskaya’s培养基、TSA培养基等，均由青岛高科技工业园海博生物技术有限公司生产。DF培养基、ADF培养基参照许芳芳[13]的方法配制。上述培养基在灭菌使用前，均另加2% NaCl。

1.2 试验方法

1.2.1根际土壤的收集 盐爪爪植株样品采用垂直挖掘法，尽可能保证根部的完整性。选择完整植株根部，采用抖落法去除非根际土壤，并在无菌条件下，利用无菌细毛刷轻刷根部，收集根际土壤样品。土样充分混合后转移至无菌离心管中，于4 ℃环境保存备用[14]。

1.2.2PGPR菌株的分离 在超净工作台中称取5 g盐爪爪根际土样，加入装有50 mL 2% NaCl无菌溶液的三角瓶中。30 ℃、120 r·min-1振荡 0.5 h，静置10 min。吸取上述悬液1 mL，经适度梯度稀释后，涂布至含有2% NaCl的分离培养基平板上，于30 ℃恒温培养3～15 d，待菌落长出后，根据菌落的形态、大小、颜色等进行初步筛选，分离纯化后，接至2% NaCl R2A培养基斜面上，4 ℃保存备用[14]。

1.2.3菌株的分子鉴定 使用菌落PCR法，采用细菌16S rDNA序列通用引物27 F和1 492 R扩增。PCR产物经切胶纯化后，送往北京鼎国生物技术有限公司进行测序。所得序列经手工校对后，上传至EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)数据库进行比对，并调取相关同源性最高模式菌株序列, 使用MEGA 5.0进行CLUSTAL X多重比对[15]，并使用NJ(Neighbor-Joining)法构建系统发育树，自举值(Bootstrap)为1 000，初步确定菌株的生物学分类地位。

1.2.4菌株耐受性测定 选取各属种代表性的14株菌株进行耐盐促生实验，菌株接种于含有2% NaCl的1/10 TSA液体培养基中，分别采用10和45 ℃恒温培养，确定其低温和高温生长情况。菌株接种于含有10% NaCl的1/10 TSA培养基中，于 30 ℃恒温培养3～15 d，连续观察并进行耐盐特性统计[14]。

1.2.5解磷和固氮能力测定 将14株代表性菌株点植到改良PKO 固体培养基上，30 ℃培养72 h，根据溶磷圈直径与菌落直径的比值大小初步判断菌株溶磷能力的强弱。菌株的固氮特性以菌株在Ashby培养基上生长，初步确定为固氮阳性[13]。

1.2.6ACC脱氨酶阳性菌筛选 参考Penrose等[16]的方法，将14株代表性菌株接种至液体无氮培养基中，30 ℃、200 r·min-1振荡培养24 h。吸取培养液0.1 mL 接种至5 mL DF液体培养基中，振荡培养24 h。吸取上述培养液0.1 mL接种至ADF液体培养基中，振荡培养48 h后，重复转接ADF培养基中，能生长的菌株判定为ACC脱氨酶阳性菌株。

1.2.7IAA产生能力测定 将待测菌株接种含有2% NaCl的1/10 TSA液体培养基，于120 r·min-1、30 ℃ 恒温震荡培养5 d。取菌液，10 000 r·min-1离心15 min，每1 mL上清液加0.5 mL Salkowski 试剂。室温暗处显色1 h 后，于530 nm处测OD值[17]。以空白培养基作对照，并以IAA标准曲线计算发酵液中IAA浓度。

1.2.8棉花促生的穴盘验证试验 菌株通过相关促生定性定量分析后，选取12株代表性菌株进行盆栽验证。采用4×5穴的穴栽盘，以水洗黄沙烘干后为穴栽土壤。土壤用5% NaCl溶液浸润后，添加过夜放置自来水并混匀，最终使土壤含水量达到50%，含盐量达到0.75%。选择颗粒饱满且无明显破损的棉种，使用0.1%的升汞消毒5 min，无菌水洗净后，浸于1/100浓度菌液4 h后，点植入穴栽盘，每穴为4粒，深度约1.5 cm，放置于人工气候箱培养，光照强度24 000 lx，光照时间14 h·d-1，光照时温度控制到30 ℃，无光照时温度控制到25 ℃，湿度控制为40%。每种菌剂处理重复4穴，以在清水浸泡为对照1(CK1)，并以清水浸泡点植于无盐土壤中为对照0(CK0)，每天用过夜放置自来水喷洒2次。待发芽后，每隔5 d浇灌一次(每穴约10 mL)。待发芽20 d后，测量各试验组和对照组棉花植株的各种形态学参数，包括发芽率、株高、根长、干重等[18-19]。

1.3 数据处理

采用DPS 7.05软件对数据进行统计分析，采用Office Excel 2003软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 盐爪爪PGPR菌株的分离与鉴定

2.1.1盐爪爪PGPR菌株分离纯化 培养3～15 d后，通过观察菌落形态，共挑取各类菌株74株。通过进一步分离纯化，菌落形态和显微形态观察去重后，共获得试验菌株57株。所得菌株保存至2% NaCl的R2A斜面上，用于进一步实验分析。

2.1.2盐爪爪PGPR菌株多样性分析 由图1可知，盐爪爪根际PGPR菌株存在丰富的多样性，所得菌株共归属在4个门12个属。其中，放线菌门(Actinobacteria)所含菌属最多，共涉及6个属；其次为变形杆菌门(Proteobacteria)，涉及3个属；再次为厚壁菌门(Firmicutes)，涉及2个属；拟芽孢杆菌(Bacteroidetes)最少，仅涉及Sinomicrobium属。

图1 基于菌株16S rDNA序列的NJ进化树

2.2 菌株耐盐促生分析结果

表1显示，经测试，86%的试验菌株具有耐受10% NaCl的能力，50%的菌株具有产ACC脱氨酶能力，50%的菌株具有解无机磷能力，42.8%具有固氮能力，86%的菌株具有产IAA的能力。其中，菌株CM7产IAA能力最强，最高可达45.32 mg·L-1(图2)，展现了盐爪爪根际PGPR菌株在耐盐促生中应用前景。

图2 典型菌株产IAA的测定结果

表1 典型菌株耐盐及促生特性分析结果

2.3 棉花穴栽盘验证试验结果

2.3.1菌株对棉花发芽率和干重的影响 从图3可以看出，盐分对棉花发芽率有明显的抑制作用，与正常发芽率95%相比，试验条件下未加菌液处理的棉种发芽率几乎降低了一半，仅为50%左右，但对成活棉株的平均干重影响不明显。多数试验菌株处理可提高棉种在盐胁迫下的发芽率，其中接种菌株R11提高最为明显，发芽率达到75%，较未接种菌液处理发芽率最高可以提高25%；其次为菌株K18，其发芽率可以提高65%；其他菌株提高不明显。而添加了MM18后，发芽率反而下降，仅为35%。干重数据显示，以CK1处理的干重为基准，添加R11、K27、CM7等菌株处理后，棉株干重明显提高，其中CM7处理最为明显，干重较CK1处理提高了22.1%；而T25、K18等菌株处理对干重增加不明显；菌株Y24处理后，棉株干重反而下降。

图3 菌株处理对棉花发芽率和棉株干重的影响

2.3.2菌株处理对棉花株高和根长的影响 图4显示，试验菌株处理可以有效提高棉苗根的生长，在出芽后3 d，与CK1比较，菌株处理后的棉苗根系生长即有明显变化，其中R11、T25、K18等菌株处理后根系生长较好。进一步培养至20 d后，不同处理间根系差异更为明显(图5)，其中R11提高最为显著，与CK1相比提高了135.2%。棉苗株高结果(图6)也表明，菌株处理可以有效提高棉株生长，与CK1比较，R11、Y24、H9、T25、K18等菌株处理后，株高明显提高，其中R11提高最为明显，较CK1提高了46.1%。

图4 典型菌株处理下棉花发芽3 d后的生长情况

注:不同小写字母表示差异在P<0.05水平具有显著性。

注:不同小写字母表示差异在P<0.05水平具有显著性。

3 讨论

已有研究表明，PGPR可有效提高种子萌发率、促进根系生长、增加植物干重，特别是其定殖能力强，对根部的病原物具有抑制作用，是现代绿色农业、生态农业发展中化肥、农药的理想替代品。目前，国内外相关学者已从多种植物根际分离到丰富多样的根际，如芽孢杆菌属[7,8,12]、假单胞菌属[9,13,18]、肠杆菌属[13-14]、土壤杆菌属[14]、德氏菌属[10,19]、克雷伯氏菌属[19]、固氮菌属[4,19]等菌株。本研究中，从盐爪爪根际微生物中，分离到在4个门12个属21个种，多数菌株具有根际促生作用，其中，如Isoptericola、Sinomicrobium等属此前鲜有相关报道，也暗示盐生植物中可能蕴藏着丰富的尚未开发利用根际促生微生物，有待进一步挖掘。

一般而言，高浓度盐分对植物生长有不同程度的抑制作用，但盐生植物在长期的适应和进化中，也形成了多种耐盐机理，主要可分为泌盐、拒盐和稀盐3种类型[20]。新疆素有世界盐碱土博物馆之称，盐碱种类多分布广，耐盐植物也多有分布。关于根际促生细菌提高植物耐盐特性的机理主要包括诱导植物体内激素变化或自身产生相关植物激素，如IAA等，诱导植物产生渗透保护剂，产生胞外多糖减轻盐胁迫，调控植物体内离子平衡等[13,18]。同时，部分菌株具有解磷解钾、固氮等功能，也为植物生长提供了营养物质，以促进植物生长，减轻盐胁迫对植株的影响。

盐爪爪作为典型稀盐植物，在盐胁迫下，植株地上和地下部分积累 Na+的程度随着土壤环境 NaCl浓度升高而增强。同时，盐爪爪根际土壤中多种离子浓度显著提高，盐分积累可在根际形成“盐岛”效应。盐爪爪根际存在丰富的微生物多样性，且多数菌株呈现较高的耐盐特性[14]。前期研究表明，盐爪爪根际微生物群落活性总体呈现根际>根区>环境的趋势[21]。本研究中，86%的试验菌株具有耐受10% NaCl的能力，50%的菌株具有产ACC脱氨酶能力，50%的菌株具有解无机磷能力，42.8%具有固氮能力，86%的菌株具有产IAA的能力。一方面展现了盐爪爪根际存在着丰富的耐盐促生菌株，另一方面耐盐促生菌株有可能参与了盐爪爪耐盐、聚盐等生理特性，这有待进一步深入研究。

本研究采用耐盐促生细菌处理棉种后，通过穴栽试验证明了R11、T25、K18等菌株处理能有效提高棉花在盐碱胁迫下的生长。其中，菌株R11处理后植株的株高和根长提高了135.2%和46.1%，这与赵雅峰等[22]的研究结果一致，也展现了菌株R11在棉花促生中良好前景。同时，采用菌株Y24处理后，尽管棉株的根系和株高增加了，但其干重反而下降，可能原因是Y24具有较强的促生长作用，由于穴载培养营养不足，加之种植时间短，过度的生长反而导致消耗能量比较多，不利于苗期植物干物质的增加，相关机理还需进一步验证。此外，部分盐爪爪根际促生菌对棉花生长的影响不明显，甚至出现一定的抑制作用，这可能与相关菌株对棉花定殖效果差，或影响棉花根际正常菌群生长等有关，相关问题还有待进一步分析。同时，在进行棉花穴栽试验时，采用水洗沙作为穴栽土壤，存在着浇水后随着水分的蒸发，盐分向上聚积的情况，可能造成植株所受的盐分胁迫大于采用松软基质。同时，也存在水洗沙营养不足等情况，导致部分菌株处理后植株发芽率和干重增加不明显，上述问题还将有待进一步验证。