重金属铊胁迫下水稻(Oryza sativa L.)根系草酸含量与铊吸收的关系

刘芳, 王摸云, 杨睿祺, 杨钊楠, 张平, 姚焱*

(1.广州大学生命科学学院, 植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室, 广州 510006; 2.广州大学化学化工学院, 广州 510006)

铊(thallium，Tl)是一种非必需的剧毒重金属元素[1]。Tl元素在自然环境中以Tl(Ⅰ)和Tl(Ⅲ)两种氧化还原状态存在。与Tl(Ⅲ)相比，Tl(Ⅰ)在热力学上更稳定，是环境中Tl元素的主要存在形式。Tl是一种强烈的神经毒物，通过食物链或被植物吸附进入生物体中，会产生神经系统障碍、中毒性肝病、致突等严重毒性问题[2]。水稻(OryzasativaL.)是世界最重要的粮食作物之一。关注水稻Tl胁迫下Tl的吸收及耐性机制，对保障水稻正常发育和粮食的安全稳定非常重要[3]。植物有两种应对重金属胁迫的耐受机制，即外部排斥机制和内部螯合机制。有机酸阴离子可与重金属形成稳定的螯合物，并降低重金属的生物毒性，研究证明有机酸在这两种机制中都发挥了重要作用[4]。因此，研究植物体内有机酸的分泌和代谢机制，对于了解植物对重金属的耐受性具有重要意义。

阴离子通道抑制剂，如9-蒽甲酸(A-9-C)、4,4′-二异硫氰酸噻吩-2, 2′-二磺酸盐(DIDS)、尼氟酸(NIF)和苯基乙二醛(PG)，常用于研究有机酸分泌物的模式和机制。许多研究表明,特定的膜定位转运蛋白与阴离子通道分泌的有机酸相关[5]。然而，不同阴离子通道抑制剂对不同物种具有不同的影响。此外，蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHM)在许多相应研究中都有应用。Yang等[6]研究发现，铝(Al)胁迫下添加CHM对荞麦根中的草酸分泌没有影响，而决明子中的柠檬酸分泌则被CHM完全抑制。因此认为，在模式Ⅱ植物决明子中需要从头合成和激活阴离子通道以促进决明子中Al诱导的柠檬酸分泌，但是在模式Ⅰ植物荞麦中存在Al诱导下分泌草酸的质膜蛋白(阴离子通道)。

草酸是最小的二甲酸，是铝胁迫下荞麦根系分泌的有机酸[7]、铅胁迫下水稻根系分泌的有机酸[8]，也是镉诱导下番茄和东南景天根系分泌的有机酸[9-10]的主要成分。前期研究结果表明，草酸是Tl胁迫下水稻根系分泌的特异性有机酸[11]，然而，Tl胁迫诱导的草酸分泌机制仍然未知。

本研究以水稻为研究材料，以10和25 μmol·L-1两个Tl浓度分别处理水稻2和12 h，测定草酸分泌和植物体内Tl含量变化，探讨Tl在水稻植株中的吸收和分布特征；并通过加入阴离子通道抑制剂PG和NIF以及蛋白质合成抑制剂CHM，研究抑制剂对Tl胁迫下草酸分泌的影响，以及Tl吸收能力与根系内部草酸含量的关系。本研究将有助于更好地了解水稻在Tl胁迫下的吸收和耐受机制。

1 材料和方法

1.1 植物材料和培养方法

选用常规水稻品种‘华粳籼’作为试验材料，由华南农业大学张桂权教授提供。采用水培方式，将水稻种子在26 ℃黑暗萌发。5 d后，将发芽种子移入1.1 L的育苗盆中(放入一个水稻苗支架，4个孔，每孔1个苗)，育苗盆中为通气营养液。根据Yoshida等[12]配方制备营养液：2.9 mmol·L-1NH4NO3，0.32 mmol·L-1NaH2PO4，1.0 mmol·L-1K2SO4，1.0 mmol·L-1CaCl2，1.7 mmol·L-1MgSO4·7H2O，9.1 μmol·L-1MnCl2·4H2O，0.52 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O，18 μmol·L-1H3BO3，0.15 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.16 μmol·L-1CuSO4·5H2O，36 μmol·L-1FeCl3·6H2O。培养的前3 d使用营养液浓度减半并把pH调至6.0，之后每3 d更换一次全营养液。胁迫处理前，将15 d秧龄的幼苗培养液更换为含3.0 mmol·L-1Ca(NO3)2、1.5 mmol·L-1MgSO4、pH 6.0的处理液后过夜[13]，之后进行处理。所有试验均在RTOP-500D人工气候培养箱(浙江托普云农科技)中进行，培养条件：12 h光照/12 h黑暗，昼夜温度25/22 ℃，光照强度350 μmol·m-2·s-1，相对湿度75%。

1.2 试验设计

对经3.0 mmol·L-1Ca(NO3)2和1.5 mmol·L-1MgSO4溶液(pH6.0)中过夜预处理的水稻秧苗，进行Tl胁迫处理，包括去离子水处理(对照，-Tl)、10(Tl10)和 25 μmol·L-1Tl处理(Tl25)共3个处理。每个处理3次重复，每个重复使用30株15 d秧龄的幼苗。

为了检验PG和NIF两种阴离子通道抑制剂和蛋白质合成抑制剂CHM对根系分泌、根和叶中草酸含量，以及根和叶中Tl含量的影响，将15 d秧龄幼苗浸泡在3.0 mmol·L-1Ca(NO3)2和1.5 mmol·L-1MgSO4溶液(pH 6.0)，过夜后进行以下7个处理，均处理12 h：①25 μmol·L-1Tl(Tl);②25 μmol·L-1CHM(CHM);③25 μmol·L-1Tl + 25 μmol·L-1CHM(Tl+CHM);④25 μmol·L-1Tl + 50 μmol·L-1PG(Tl+PG)；⑤25 μmol·L-1Tl + 50 μmol·L-1NIF(Tl+NIF)；⑥25 μmol·L-1Tl + 50 μmol·L-1PG + 25 μmol·L-1CHM(Tl+PG+CHM)；⑦25 μmol·L-1Tl + 50 μmol·L-1NIF + 25 μmol·L-1CHM(Tl+NIF+CHM)。处理后将稻苗转移到去离子水中培养6 h，然后冷冻干燥蒸发除去根分泌物中的水分。

1.3 根系草酸含量检测

根系外泌有机酸收集方法：稻苗分别处理2和12 h后转移到去离子水中静置6 h，用冻干法浓缩去离子水中的根系分泌物，残留物溶解在2 mL 0.01 mol·L-1K2HPO4缓冲液(pH 2.75)中，再由0.45 μm滤膜过滤后上机检测。

根系内有机酸收集：将根系在3 mL含0.25 mol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和1 mmol·L-1巯基乙醇的提取缓冲液中冰浴研磨，4 ℃、2 000 r·min-1离心15 min，通过0.45 μm 滤膜过滤后，上机进行HPLC(Shimadzu Prominence LC-20A，Japan)检测。

检测的色谱条件：流动相由0.01 mol·L-1K2HPO4缓冲液(pH 2.75)和甲醇组成，以97∶3的比例配制，流速0.6 mL·min-1，柱温30 ℃，进样体积20 μL，检测波长210 nm，检测时间10 min。

1.4 植物中的Tl含量检测

水稻幼苗在含铊处理液中分别处理2或12 h后，移去水稻幼苗，收集处理溶液并通过0.45 μm膜滤器过滤，利用火焰原子吸收光谱仪(FAAS，Shimadzu)测定处理液中残存的Tl含量，同时测定水稻根系和叶片中的Tl含量：用去离子水冲洗根部3次，然后用滤纸吸干根部表面水分。分别测定根和叶的鲜重。随后将根和叶片在105 ℃烘箱中干燥至恒重，用稀盐酸浸泡12 h。最后，取3 mL浸泡液过滤后通过火焰原子吸收光谱仪测定Tl含量。

测定细胞壁、根和叶细胞质中Tl含量：取0.10 g新鲜的根或叶，加入3 mL含0.25 mol·L-1蔗糖、1 mmol·L-1巯基乙醇、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH7.5)的提取液，冰浴研磨，4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min，得到沉淀成分，将上清液15 000 r·min-1离心30 min获得上清液组分[14]。将沉淀用3 mL稀盐酸浸泡12 h，过滤并通过FAAS测定细胞壁中的Tl含量。过滤最终的上清液并测定，记为细胞质中的Tl含量。

1.5 数据统计与分析

使用SPSS 16.0软件对试验数据进行单因素方差分析，并通过Duncan检验比较各组间差异。

2 结果与分析

2.1 Tl胁迫下水稻植株的草酸分泌和Tl分布特征

目前，草酸是水稻在Tl胁迫下根系向外分泌的唯一一种有机酸。由图1可知，对照组(-Tl)2和12 h的水稻根系向外分泌草酸量极低；2 h后Tl10处理的根际草酸含量为2.00 mg·g-1FW，Tl25处理的分泌量上升至4.47 mg·g-1FW；但12 h后两个处理的根际草酸含量均下降，Tl10处理的根际草酸含量下降至0.66 mg·g-1FW，Tl25处理的根际草酸含量降至2.50 mg·g-1FW。-Tl处理的根系草酸含量在2 h后为16.15 mg·g-1FW，与Tl25处理2 h的值(18.65 mg·g-1FW)无显著差异；2 h时Tl10处理的根系草酸含量显著高于-Tl处理。12 h后，各处理间根系内草酸含量没有显著差异。结果表明，Tl胁迫浓度升高会导致水稻根系外泌的草酸含量升高，但随着Tl处理时间的延长，水稻根系外泌草酸含量反而下降。Tl胁迫主要影响根系向外分泌的草酸量，对根系内部草酸含量影响不显著。

注：不同小写字母表示不同处理间差异具有显著性。

为研究重金属Tl在水稻体内的吸收与分布特征，测定了水稻不同部位的Tl含量，结果(表1)表明，Tl10处理12 h，整株水稻的Tl含量为0.018 mg·g-1FW，Tl25处理为0.035 mg·g-1FW，显著高于Tl10处理。在Tl10和 Tl25处理下，根中的Tl含量约为整株水稻中总Tl含量的73.8%和77.2%，而叶中Tl含量仅为整株含量的26.1%和23.8%，两个处理间均没有差异。此外，Tl10和 Tl25处理的根细胞质的Tl含量分别约为水稻植株总Tl含量的56.3%和59.6%，高于根细胞壁和叶细胞质中的Tl含量。因此，Tl在水稻中的主要积累部位为根系，特别是根细胞质中。

表1 Tl处理后水稻中Tl的吸收和分布

2.2 抑制剂对水稻草酸含量及Tl含量的影响

为了研究Tl胁迫下草酸分泌的模式，将阴离子通道抑制剂PG和NIF,及蛋白质合成抑制剂CHM分别加入到Tl处理中，12 h后，测定根际、根内和叶内的草酸含量。由图2可知，Tl处理的根际草酸含量为2.5 mg·g-1FW，而Tl处理分别添加3种抑制剂后，草酸分泌量发生了变化。NIF效果最为显著，完全抑制了草酸的分泌；PG也具有较好的抑制效果，草酸分泌量降低至0.18 mg·g-1FW；CHM处理的根际草酸含量降至1.955 mg·g-1FW，但与Tl处理无显著差异。对于根系内草酸含量，Tl处理的根内草酸含量为15.44 mg·g-1FW，添加CHM和NIF后根内草酸含量显著降低至12.32 和6.05 mg·g-1FW，而PG处理的抑制效果不明显。对于叶内草酸含量，这3种抑制剂添加均未对其产生显著影响。因此，阴离子通道抑制剂NIF和PG在Tl胁迫下对水稻根外泌的草酸含量起明显抑制作用，而蛋白质合成抑制剂CHM基本不影响根系内和外分泌的草酸含量。3种抑制剂对根系内的草酸含量影响较小，对叶片内草酸含量没有影响。

注：不同小写字母表示不同处理间差异具有显著性。

Tl处理下，植株内部的Tl元素总含量为0.034 mg·g-1FW，其中根的Tl含量最高，为0.35 mg·g-1FW。Tl处理下添加PG、NIF和CHM后，均显著降低水稻植株对Tl的吸收量，处理后植株的Tl含量分别为0.031、0.014和 0.029 mg·g-1FW，NIF的抑制能力最强。3种添加剂对根Tl含量影响的规律与植株基本一致。Tl处理的叶片Tl含量为0.095 mg·g-1FW，添加NIF后显著下降为0.038 mg·g-1FW，添加PG和CHM后的叶片Tl含量与对照无显著差异。因此，抑制剂NIF对植株、根及叶的Tl含量均有显著抑制作用。

2.3 根内草酸含量与水稻Tl吸收能力的关系

对Tl胁迫下水稻植株根系内草酸含量与植株Tl吸收量进行相关性分析，结果(图3)表明，水稻根内草酸含量与植株体内Tl含量存在线性关系，且相关系数达到0.923, 相关性达到极显著水平(P<0.01)。

3 讨论

3.1 阴离子通道影响Tl胁迫下水稻根系的草酸分泌

水稻秧苗Tl处理2 h后，根系分泌的草酸量随着Tl胁迫强度的升高而增加，Tl处理时间延长至12 h时，草酸分泌量逐渐降低。此现象表明，Tl可以快速激活水稻草酸的分泌，激活能力与Tl胁迫浓度相关。当阴离子通道抑制剂NIF加入到Tl胁迫的水稻处理液中，根系外分泌和根系内部的草酸含量被显著抑制；而蛋白质合成抑制剂CHM添加不会显著影响根的草酸分泌与含量。这表明，阴离子通道对Tl胁迫下草酸的分泌有重要影响。虽然PG和NIF均可抑制草酸的分泌，但NIF的抑制能力明显强于PG，NIF不仅可以抑制水稻根系向外分泌草酸，还可以降低根系内部的草酸含量。推测可能是NIF抑制了水稻根中草酸分泌通道蛋白的活化。但调节草酸分泌的草酸转运蛋白与重金属胁迫下草酸的分泌是否有关，还有待进一步证实[15]。

研究者普遍认为，重金属胁迫下植物根尖有机酸分泌有两种模式。模式Ⅰ植物中重金属直接激活细胞壁表面的阴离子通道，从而分泌有机酸以螯合重金属，此过程不涉及到新蛋白质的合成与DNA的表达，对重金属胁迫反应迅速[16]。模式Ⅱ植物在受到重金属胁迫时，有机酸的分泌需要依靠离子通道蛋白的合成，激活有机酸的分泌需要一定的时间，如决明根系分泌柠檬酸需要一定的反应时间，也会被蛋白抑制剂CHM所抑制[6]。基于本研究中水稻在Tl胁迫下的草酸分泌特征，初步认为水稻根中的草酸分泌模式属于模式Ⅰ。

本研究发现，Tl胁迫下根系外分泌的草酸含量变化与根内草酸含量变化没有密切关系。Ma等[17]也曾报道过类似结果，在Al胁迫下有机酸阴离子的向外分泌不受根系内部有机酸水平或根细胞合成有机酸能力的调节。这表明某些重金属胁迫下植物根系有机酸分泌机制可能存在相似性。

3.2 Tl胁迫下水稻的内部耐受机制

有机酸在植物对重金属外部和内部解毒中起重要作用。内部解毒是指细胞质中螯合重金属的有机酸、液泡的区室化、或细胞内部的蛋白质与重金属结合，从而降低重金属对植物的毒性等[18-19]。荞麦中的草酸与Al形成稳定的螯合物，有效降低了游离Al3+离子对植物细胞的毒性，提高了荞麦对铝的耐受性[20]。本研究发现，水稻根系内草酸含量与水稻全株Tl含量的相关系数为0.923，根系内草酸含量与植物体内Tl吸收量呈极显著正相关。推测Tl与草酸能够形成稳定物质以降低水稻细胞内游离Tl+含量，从而提高对Tl的耐受。水稻应对Tl胁迫的解毒机制可能与荞麦体内草酸解除Al毒机制有相似性，但还需要进一步验证。

本研究首次提出Tl胁迫下促进水稻根系草酸分泌的模式属于模式Ⅰ；明确了阴离子通道抑制剂NIF对Tl胁迫水稻根系草酸分泌的显著抑制作用；水稻根系内部草酸含量与Tl吸收量正相关，揭示了草酸对水稻植株内部耐受Tl的贡献，为进一步揭示Tl胁迫下水稻细胞及分子层面的耐受机制奠定基础。