不同成熟期烤烟主脉中膜脂过氧化及其与衰老相关基因的关系探究

范宁波, 周俊学, 江凯, 王宏, 史龙飞, 高玉龙, 陈颐

(1.河南农业大学烟草学院, 郑州 450002; 2.河南省烟草公司洛阳市公司, 河南 洛阳 471000; 3.云南省烟草农业科学研究院, 昆明 650031)

烤烟是一种广泛种植的经济作物，在我国国民经济中占有重要地位[1]。在影响烟叶质量的诸多因素当中，烟叶的成熟度占据着首要地位，好的成熟度才能够保证烤后烟叶的良好品质及可用性[2]。烟草的成熟过程也是衰老过程，目前关于植物衰老的各种学说有自由基衰老学说、内源激素调节学说和细胞程序性死亡学说等，其中最被认可的为自由基衰老学说[3]，该学说认为植物衰老的过程即活性氧代谢失调、不断积累的过程[4]。活性氧是生物体新陈代谢产生的一大类副产物，它的代谢失衡与膜质过氧化是生物衰老的重要原因[5]。烟叶的成熟度不同，其活性氧的积累差异很大[6]，采收成熟度是影响烟叶可用性的重要指标[7-8]。活性氧具有极高的活性和毒性，会对一些生物大分子物质(如脂质、蛋白质和DNA等)产生氧化破坏，使有毒物质积累增加，甚至引起细胞死亡[9]。因此，对烤烟成熟过程中活性氧及膜脂过氧化产物积累进行研究，对烟叶的成熟采收具有重要意义。关于烟草叶片的活性氧研究已有不少，活性氧的积累也经常被用作烟草抗逆能力的衡量指标[10-12]。植物的衰老是一个受多基因调控的积极调节过程。烟草中NtCP1和NtCP2是编码半胱氨酸蛋白酶的基因，其中NtCP1是一个高度衰老特异表达基因，只在自然衰老的烟草中表达，具有很强的稳定性，不容易被外界环境所影响；NtCP2在成熟的烟草叶片中表达，但在衰老叶片中表达下调，且容易被逆境胁迫所影响，二者是烟草中常见的与衰老有关的基因[13]。由于烟草的工业用途，关于烟叶的研究一般都集中在叶片中，而对于烟叶主脉的研究却很少，关于烟叶在成熟和衰老过程主脉中活性氧等物质的变化更是尚未见报道。叶脉对于植物叶片的水分运输和生长至关重要[14-15]，并且烟草的叶片主脉可以有效影响烟叶的烘烤品质，因而烟叶主脉对于烟草品质的影响更加深远[16-17]。本研究以烤烟品种‘K326’和‘豫烟6号’为试验材料，研究采后烟叶主脉中的活性氧、膜脂过氧化产物积累以及相关衰老基因表达规律，旨在从主脉的角度来衡量烟叶的成熟状况，从而为烟叶的成熟采收提供理论指导和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年在河南省洛阳市洛宁县烟叶标准化生产示范田进行，选用当地主栽烤烟品种‘K326’和‘豫烟6号’为试验材料，试验田土壤为黄棕壤，土壤基本理化性质：pH 7.26，有机质13.52 g·kg-1，碱解氮75.18 mg·kg-1，速效磷9.17 mg·kg-1，速效钾164.37 mg·kg-1，每株留叶数均为18片，田间管理措施均按照当地优质烟叶生产技术规程进行[18]。

1.2 试验设计

依据赵铭钦等[19]对于成熟度的划分，将烟叶分别设定为欠熟、未熟、尚熟、适熟和过熟5个成熟度，分别选取长势一致的烟株进行取样，取样部位为中部叶(10～12叶位)，将烟叶的主脉从叶片中剥离备用。一部分样品在采集后立即放入干冰中速冻带回实验室，并转移至-70 ℃冰箱中保存备用，用于相关生理指标检测和基因表达测定，其他样品用于NBT化学组织染色。每个时期进行3次生物学重复。

1.3 测定指标及方法

1.3.1NBT组织化学染色 用吉列双刃刀片于载玻片上取1 mm厚的烟叶主脉截面(靠近端口处)切片，将主脉切片投入盛有0.1% NBT的离心管中，染色48 h后取出主脉切片，吸干水分，在M165 FC立体式显微镜(LECIA, 德国)下拍照并分析染色情况[20]。

1.3.2O2-、H2O2和MDA含量的测定 分别使用超氧阴离子测试试剂盒(SA-2-G，苏州科铭生物技术有限公司)、过氧化氢测试试剂盒(H2O2-2-Y，苏州科铭生物技术有限公司)，并严格按照说明书测定O2-和H2O2含量，使用硫代巴比妥酸法[21]测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.3衰老相关基因表达的测定 以未熟的‘K326’烟叶主脉作为对照，使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测基因的相对表达量。从GenBank核酸数据库中检索烟草NtCP1、NtCP2序列并设计相关引物，以烟草核糖体蛋白基因L25为内标基因。引物用Roche LCPDS2软件设计，并由北京擎科新业生物技术有限公司合成。使用R1200-50T RNA抽提试剂盒(索莱宝)提取总RNA，利用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并将待测RNA逆转录成cDNA。利用QuantiFast©SYBR©Green PCR Kit试剂盒(Qiagen，Germany)在LightCycler©480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上进行反应。qRT-PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，85 ℃反应5 s，40个循环。基因相对表达量的计算采用 2-ΔΔCt法[22]。

表1 衰老相关基因引物序列

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2010 进行数据处理、分析及绘图，采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度烟叶主脉的NBT染色结果

NBT组织化学染色结果(图1)显示，随着烟叶成熟度的增加，其烟叶主脉的活性氧也会逐渐积累。在未熟烟叶中，主脉不产生蓝色沉淀；当烟叶达到欠熟状态时，主脉中略有蓝色沉淀产生；当烟叶表现为尚熟和适熟阶段时，主脉切片中产生的蓝色沉淀明显增多；而当烟叶过熟时，蓝色沉淀几乎覆盖了整个主脉切片，表明活性氧在过熟叶片的主脉中大量积累，且‘K326’和‘豫烟6号’两个品种烤烟主脉染色的变化趋势一致，二者间基本没有差异。可见，烟叶的成熟过程也是活性氧物质积累的过程。

图1 不同成熟度烟叶主脉的NBT染色

2.2 成熟过程烟叶主脉的活性氧物质累积

由图2可知，在烟叶成熟过程中，‘豫烟6号’主脉中的O2-含量一直高于‘K326’。在烟叶未熟时，‘K326’和‘豫烟6号’的O2-含量之间没有显著差异，随着成熟度的增加，两者之间的差别开始增大，在欠熟、尚熟和适熟时，两个品种之间差异显著。随着成熟度的增加，两个品种烟叶主脉中O2-的增加速率均表现出慢-快-慢-快的变化趋势。H2O2和MDA含量的变化与O2-含量的变化趋势基本一致，随着烟叶成熟度的增加也均逐渐增加。相对于未熟时期，当烟叶达到过熟程度时，‘K326’中的O2-、H2O2和MDA含量分别增加了2.81、2.02、3.59倍；‘豫烟6号’的O2-、H2O2和MDA含量分别增加了2.40、1.85和3.67倍。

注:*表示两个品种间差异在P<0.05或P<0.01水平具有显著性。

2.3 成熟过程中烟叶主脉衰老相关基因的表达

为了从分子水平上探索烟草主脉的衰老机理，本研究对衰老相关基因的表达进行了检测。结果如图3所示，在烟叶的成熟过程中，‘K326’和‘豫烟6号’烟叶主脉的NtCP1基因表达均呈持续上升趋势，且在烟叶过熟时期基因表达量最高。两个品种的NtCP2基因的表达趋势也一致，但NtCP2的表达趋势与NtCP1有很大差异，成熟过程中，其表达量逐渐增加，在尚熟时达到最大值，然后其表达量又逐渐降低，直至在过熟时该基因的表达量低于未熟时期。在‘K326’和‘豫烟6号’两个品种之间，仅在尚熟和适熟时期NtCP1的基因表达量存在显著差异，其他时期两个基因的表达在品种间均没有显著差异。

2.4 烟叶成熟过程中活性氧与衰老相关基因表达的相关性

对烤烟主脉中活性氧含量和衰老相关基因表达量进行相关分析，发现在‘K326’的主脉中，MDA、H2O2和O2-三者存在极显著正相关关系(P<0.01)。MDA、H2O2、O2-与NtCP1之间均存在极显著正相关关系，与NtCP2呈负相关关系，但相关性并不显著。‘豫烟6号’主脉中相关指标之间的相关规律与‘K326’一致，这说明NtCP1基因与烟草衰老的关系更为紧密。

表2 活性氧、MDA含量及衰老相关基因的相关分析

3 讨论

NBT染色法可以直观、简便、快捷地检测叶片中活性氧的产生情况，是在生命科学研究中经常采用的检测方法[20]。本研究发现，随着成熟度的增加，不同成熟度主脉的NBT染色斑的面积逐步增大，表明烟叶的成熟和衰老会导致其主脉中活性氧物质的积累。O2-、H2O2是主要的活性氧自由基，可以破坏细胞膜的结构及功能，使细胞膜透性增加[23]，而MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其积累会对细胞造成一定的伤害[24]，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。本研究发现，随着烟叶成熟度的增加，主脉细胞中活性氧物质(H2O2、O2-)逐渐积累，MDA含量增加，表明伴随着烟叶的生长发育，主脉也随之衰老，主脉细胞的膜脂过氧化程度逐渐增加，细胞膜由完整变得破裂，造成细胞衰老、死亡。

烟草中NtCP1和NtCP2皆为高度衰老特异表达基因，在细胞的程序性死亡中扮演着非常重要的角色[13]。本研究发现，叶脉中NtCP1表达量在烟草成熟过程中呈逐渐上升的趋势，基因表达规律与Beyene等[25]的研究结果一致，且与活性氧物质和MDA含量的变化趋势相吻合，这表明NtCP1基因在烟草细胞的程序性死亡过程中扮演着非常重要的角色；NtCP2的表达则呈先增加后降低的变化趋势，与活性氧物质和MDA含量之间存在负相关关系但相关性并不显著。这可能与NtCP2在成熟的烟草叶片中表达较为明显，但在衰老叶片中表达量反而下降，即基因的表达规律与烟叶的成熟规律并不一致，且与NtCP2的表达容易受到外界环境影响有关[13，18]。

在烟叶的成熟过程中，‘K326’和‘豫烟6号’主脉中的活性氧物质、MDA含量及基因表达趋势基本一致，并且整体上 ‘豫烟6号’主脉中的活性氧物质、MDA含量及基因表达量均高于‘K326’，这可能与烤烟品种自身遗传因素有关。综上所述，本研究以烟叶的主脉为研究对象，发现伴随着烟叶的成熟与衰老，烟草主脉中也会逐渐积累活性氧物质和MDA，某些衰老相关基因的表达也会发生变化。该研究结果为实际生产中利用主脉来进行烟叶成熟度的判定提供了更多的理论支持，为烟叶的优质生产提供了指导。