基于TGF-β1/Smads信号通路探讨肾宁Ⅰ号方治疗肾纤维化的作用机制

董小君，丁 斗，甘 媛，曾富佳，丁丽娜

(遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563006)

近年来，慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)成为日益严重的公共卫生问题，CKD的发生率和患病率在全球范围内急剧增加。CKD表现为肾小球滤过率降低，尿蛋白排泄增加，或两者兼而有之[1]。以肾小管间质纤维化(Tubulointerstitial fibrosis，TIF)和肾小球硬化为特征的肾纤维化是CKD的最终表现[2]，TIF的进展是一个动态过程，表现为肾小管丢失和细胞外基质(ECM)蛋白(包括纤连蛋白和胶原蛋白)的积聚[3]。大量的研究文献表明，TGF-β1被认为是肾脏中最重要的纤维化细胞因子，有几种经典的细胞信号传导途径参与了肾纤维化，如TGF-β1/Smad，Wnt/β-catenin和Integrins/ ILK[4]。单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral obstruction，UUO)动物模型被认为是阻塞性肾病的经典模型，尿流受阻引起的肾小管损伤引发肾纤维化[5]。UUO动物模型的优势在于可通过更改实验装置的时间、严重性和持续时间来方便操控[6]。中药复方防治UUO肾纤维化具有多环节、多层次、多靶点的优势。苓桂术甘汤以温阳化饮、健脾利湿为用，源自《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治》，原为中阳不足之痰饮而设[7]。本课题组根据多年临床经验，以苓桂术甘汤为基础方，加用六月雪、透骨香等贵州民族药，拟出具有补肾健脾、通络消癥功效的肾宁Ⅰ号方，临床疗效显著。为进一步探讨肾宁Ⅰ号方抗肾纤维化的可能作用机制，本课题采用UUO制作大鼠肾纤维化模型，通过观察肾宁Ⅰ号方对肾组织TGF-β1/Smads信号通路中的关键蛋白基因如TGF-β1、Smad2、Smad7等的变化，从细胞分子层次揭示肾宁Ⅰ号方抑制肾纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性大鼠72只，体质量(200 ± 18.56)g，购于成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK2015-030。本实验方案通过遵义医药高等专科学校实验动物伦理委员会批准，遵循实验动物伦理委员会指导原则。

1.2 药品与试剂

肾宁Ⅰ号方由茯苓、桂枝、白术、炙甘草、法半夏、黄连、大黄、六月雪、淫羊藿、透骨香、熟地、黄芪、太子参、三七、丹参、当归、车前子、川芎等组成，以上中药饮片均购自成都中医药大学附属医院门诊药房，制成低剂量含生药量1.76 g/mL、中剂量含生药量3.56 g/mL、高剂量含生药量5.58 g/mL的中药水煎液，4℃恒温冰箱保存；贝那普利5 mg购于成都地奥制药集团有限公司，制成1 mg/mL的水溶液。TGF-β1(ab179695)、Smad2(ab33875)和Smad7(ab216428)抗体购于英国Abcam公司。IL-4和TNF-α试剂盒购于联科生物科技有限公司。

1.3 动物分组与实验方法

将72只雄性SD大鼠随机分成6组，分别为假手术组(Ⅰ组)、模型对照组(Ⅱ组)、贝那普利阳性对照组(Ⅲ组)、低剂量肾宁Ⅰ号方组(Ⅳ组)、中剂量肾宁Ⅰ号方组(Ⅴ组)与高剂量肾宁Ⅰ号方组(Ⅵ组)。根据相关文献报道[8]和本课题组前期经验，将大鼠用10%的戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠仰卧在加热垫上进行皮肤准备和消毒。在侧面切开后，用4.0丝线缝合结扎输尿管，最后切口用缝合线逐层封闭。假手术组的动物除结扎外均进行所有手术。实验第2天开始进行中药预防干预，用药剂量按照实验动物学的剂量换算得出，低、中、高剂量肾宁Ⅰ号方分别按生药1.76、3.56、5.58 g/(kg·d)灌胃，持续给药4周，贝那普利阳性对照组按1.7 mg/(kg·d)灌胃，假手术组和模型对照组每天给予3 mL的生理盐水。

1.4 标本采集与指标监测

药物干预结束后禁食8 h，禁水12 h。麻醉后从大鼠腹主动脉收集血样。使用自动生化分析系统检测血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)含量。ELISA法测量血清炎性因子IL-4和TNF-α的含量。采血后剥离肾脏标本，固定于4%多聚甲醛，然后转移至PBS中，依次切成5 μm的厚度进行组织学分析。用苏木精对切片染色，测量肾损伤指数，包括间质纤维化、炎症、细胞浸润、间质水肿、肾小管萎缩、细胞液泡变性和肾小管扩张，以评估肾间质病变。评估每个参数并给出0～4的分数。通过Masson的三色染色评估纤维化，胶原纤维染成蓝色，其他组织染成红色。定量分析胶原沉积为胶原体积分数(胶原面积/总面积×100%)，通过Image-Pro Plus 6.0测定。用Western blot检测TGF-β1、Smad2及Smad7的蛋白表达，Quantitative PCR检测TGF-β1、Smad2和Smad7的基因表达。使用 PRIMER 3.0 及 OLIGO 6.0 软件设计引物，由武汉塞维尔公司生物合成引物，TGF-β1 Forward：catggagctggtgaaacggaag，Reverse：gactggcgagccttagtttggac；Smad2 Forward：gccgcccgaagggtagat，Reverse：ttctgttctccaccacctcctgc；Smad7 Forward：ggtgcgtggtggcatact，Reverse：gctgactcttgttgtccgaat。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 肾功能检测

如表1所示，通过BUN和Scr分析评估肾功能。与假手术组比较，模型对照组大鼠血清BUN和Scr显著升高(P<0.001)。与模型对照组比较，贝那普利阳性对照组和肾宁Ⅰ号方高、中、低剂量各组大鼠血清BUN和Scr显著降，差异具有统计学意义(P<0.001)。与肾宁Ⅰ号方低剂量组比较，肾宁Ⅰ号方中剂量组和高剂量组的大鼠血清BUN含量下降，差异具有统计学意义(P<0.001或P<0.01)；而肾宁Ⅰ号方高剂量组的血清Scr含量较低剂量组下降明显(P<0.01)，治疗组之间具有显著差异。

表1 各组实验大鼠肾功能检测

2.2 血清炎性因子检测

为了评估炎症水平，如图1所示，检测血清TNF-α和IL-4的浓度。模型对照组的血清TNF-α在各组中浓度最高(P<0.001)，经肾宁Ⅰ号方治疗后明显降低(图1(A)，P<0.001)，呈药物浓度依赖性。此外，模型对照组的血清IL-4浓度低于假手术组，但在肾宁Ⅰ号方治疗后明显升高(图1(B)，P<0.001)。结果表明，肾宁Ⅰ号方可改变UUO诱导的炎症水平，并与药物浓度成正相关。

注：(A) 各组实验大鼠血清TNF-α含量； (B) 各组实验大鼠血清IL-4含量。Ⅰ组为假手术组；Ⅱ组为模型对照组；Ⅲ组为贝那普利阳性对照组；Ⅳ组为低剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅴ组为中剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅵ组为高剂量肾宁Ⅰ号方组；n=10。与Ⅰ组比较，***P<0.001；与Ⅱ组比较，###P<0.001。与Ⅳ组比较，△△△P<0.001。

2.3 HE染色

如图2所示，HE染色用于评估肾组织的病理变化。与假手术组相比，模型对照组大鼠肾脏主要特征是中度至重度间质性肾炎。肾小球的数量减少，萎缩甚至硬化和坏死。肾小球中有大量的纤维组织增生，纤维组织包裹在动脉壁外。肾小管萎缩伴局部囊性扩张，大量纤维组织增生和大量炎症在间质细胞浸润。然而，用肾宁Ⅰ号方治疗的UUO大鼠，肾脏的整体损伤有不同程度的减弱，纤维组织的增殖得到改善，炎性细胞明显减少。

注：Ⅰ组为假手术组；Ⅱ组为模型对照组；Ⅲ组为贝那普利阳性对照组；Ⅳ组为低剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅴ组为中剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅵ组为高剂量肾宁Ⅰ号方组。

2.4 Masson染色

如图3(A)所示，通过Masson的三色染色评估纤维化，胶原纤维染成蓝色，其他组织染成红色，定量分析胶原沉积为胶原体积分数(胶原面积/总面积×100%)。与假手术组相比，模型对照组大鼠的主要特征是大量胶原沉积并分布在间隙区域。用肾宁Ⅰ号方干预的UUO大鼠的间质纤维化明显减弱(图3(B)，P<0.001)。在肾宁Ⅰ号方治疗组的每个剂量中，胶原蛋白的含量均有不同程度的降低(P<0.001)，与剂量呈现正相关。肾宁Ⅰ号方干预可显著改善UUO大鼠的肾脏病理病变并减少肾脏纤维化。

注：(A) 各组实验大鼠Masson染色；(B) Masson染色切片中胶原蛋白沉积面积的百分比(%)。 Ⅰ组为假手术组；Ⅱ组为模型对照组；Ⅲ组为贝那普利阳性对照组；Ⅳ组为低剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅴ组为中剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅵ组为高剂量肾宁Ⅰ号方组。与Ⅰ组比较，***P<0.001；与Ⅱ组比较，###P<0.001。与Ⅳ组比较，△△P<0.01，△△△P<0.001。

2.5 Western blotting法检测

如图4(A)和图4(B)所示，通过Western blotting法检测TGF-β1、Smad2和Smad7的蛋白相对表达。肾组织中的TGF-β1和Smad2蛋白表达在模型对照组中最高，而Smad7蛋白表达在模型对照组中最低，与假手术组比较均有极显著差异(P<0.001)。经贝那普利和各剂量的肾宁Ⅰ号方干预后，与模型对照组相比，TGF-β1和Smad2蛋白在贝那普利阳性对照组和肾宁Ⅰ号方治疗各组中的表达下调，有极显著差异(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，Smad7蛋白在贝那普利阳性对照组和肾宁Ⅰ号方治疗各组中的表达上调，有极显著差异(P<0.01或P<0.001)。各剂量肾宁Ⅰ号方治疗组组间比较，相对低剂量肾宁Ⅰ号方治疗组，TGF-β1蛋白表达在高剂量肾宁Ⅰ号方治疗组下调，有统计学差异(P<0.05)，Smad2蛋白表达在中剂量和高剂量肾宁Ⅰ号方治疗组下调，均有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，而Smad7蛋白表达在中剂量和高剂量肾宁Ⅰ号方治疗组上调，均有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。

注：(A)Western blotting法测定TGF-β1，Smad2和Smad7的蛋白表达；(B)各组中的蛋白相对表达。Ⅰ组为假手术组；Ⅱ组为模型对照组；Ⅲ组为贝那普利阳性对照组；Ⅳ组为低剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅴ组为中剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅵ组为高剂量肾宁Ⅰ号方组。与Ⅰ组比较，***P<0.001；与Ⅱ组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。与Ⅳ组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

2.6 Quantitative PCR检测

如图5所示，通过Quantitative PCR法检测TGF-β1 mRNA，Smad2 mRNA和Smad7 mRNA的相对表达。肾组织中的TGF-β1 mRNA和Smad2 mRNA表达在模型对照组中上调，而Smad7 mRNA表达在模型对照组中下调，与假手术组比较均有极显著差异(P<0.001或P<0.01)。经贝那普利和各剂量的肾宁Ⅰ号方干预后，与模型对照组相比，TGF-β1 mRNA和Smad2 mRNA在贝那普利阳性对照组和肾宁Ⅰ号方治疗各组中的表达下调，有极显著差异(P<0.001)，Smad7 mRNA在贝那普利阳性对照组和肾宁Ⅰ号方中高剂量治疗组中的表达上调，有极显著差异(P<0.01或P<0.001)。各剂量肾宁Ⅰ号方治疗组组间比较，相对低剂量肾宁Ⅰ号方治疗组，TGF-β1 mRNA表达在中剂量和高剂量肾宁Ⅰ号方治疗组下调，均有极显著差异(P<0.001)，Smad2 mRNA表达在中剂量和高剂量肾宁Ⅰ号方治疗组下调，有统计学差异(P<0.05或P<0.001)，Smad7 mRNA表达在高剂量肾宁Ⅰ号方治疗组上调，有显著差异(P<0.01)。

注：各组中的基因相对表达，Ⅰ组为假手术组；Ⅱ组为模型对照组；Ⅲ组为贝那普利阳性对照组；Ⅳ组为低剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅴ组为中剂量肾宁Ⅰ号方组；Ⅵ组为高剂量肾宁Ⅰ号方组。与Ⅰ组比较，***P<0.001；与Ⅱ组比较，##P<0.01，###P<0.001。与Ⅳ组比较，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。

3 讨论

近年来，CKD的发生率和患病率在全球范围内急剧增加，绝大多数病例最终发展为终末期肾衰竭，严重威胁患者的健康和生命[9]。肾纤维化被认为是所有形式CKD的最终途径，且几乎不存在针对肾纤维化的特效治疗方法[10]。因此，迫切需要找到有效的治疗方法和药物来预防和治疗肾纤维化。目前，中医药已被广泛用于对抗肾纤维化。中医把肾纤维化归属于“溺毒”“关格”“水肿”等[11]，其病机关键为脾肾亏虚、湿浊内蕴、瘀毒壅滞，治疗上因痰饮属阴，阻抑其阳，用阳药化气以伸其阳，轻清之方以通其阳，阳气化则小便能出。本课题组集多年临床经验总结出治疗效果突出，具有补肾健脾、通腑泄浊、活血化瘀的肾宁Ⅰ号方[7]，以苓桂术甘汤为底方，采用透骨香、六月雪等贵州苗药加减。清代医家陈修园在《金匮方歌括》中言：“其以茯苓为君，盖以苓者令也，使治节之令行，而水可从令而下行，桂枝振阳以退其群阴，白术补中土以修其堤岸，使水无泛滥之虞，甘草助脾气转输以交上下”。加上透骨香、六月雪活血化瘀，利湿祛毒；当归、丹参、三七等养血通络。诸药合用，共达通补兼施、通络消癥之效。

TGF-β1/Smads信号通路被认为是肾间质纤维化最经典的信号通路[12]，其转导受到一种机制调节，这种机制依赖Smad将刺激从细胞外转移到细胞核。多数研究认为TGF-β1在肾纤维化进程中起关键作用，通过Smad信号通路下游激活而发挥其生物学功能[13]。目前研究[14]表明，抑制TGF-β1信号转导下调Smad2和上调Smad7可能是治疗肾间质纤维化的有效方法。Smad7具有调节TGF-β1/Smads信号通路的作用，是一种自我调节的负反馈信号。Smad7抑制Smad的磷酸化，从而通过与TGF-α的竞争结合，阻止靶基因的转录。在本实验中，肾宁Ⅰ号方各剂量组干预后使Smad2表达明显降低。与之相比，肾宁Ⅰ号方各剂量干预后Smad7的基因和蛋白表达显著上调。

综上，本课题通过肾宁Ⅰ号方治疗UUO大鼠模型及其对肾组织TGF-β1/Smads信号通路转导的影响发现，肾宁Ⅰ号方干预后能显著降低UUO大鼠的血清BUN和Scr水平，明显改善炎症水平，并减轻UUO大鼠肾脏纤维化的病理病变和纤维化程度，高剂量的肾宁Ⅰ号方效果最佳。此外，肾宁Ⅰ号方的干预改变了TGF-β1、Smad 2和Smad7蛋白和基因的相对表达，提示肾宁Ⅰ号方可能是通过调节TGF-β1/Smads信号通路治疗肾纤维化。