放炎方对大鼠放射性肺损伤及其TGF-β1、IL-6的影响

刘 伟，兰东强，王 柱，唐伟智，冯叶超，牛俊杰，简小兰

(湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006)

既往临床已证实放炎方对放射性肺损伤有较好疗效，具有促进炎症吸收、改善临床症状、提高患者生存质量的作用[1]。放炎方为我院中西医结合专家兰东强的经验方，具有清热养阴润肺、活血通经化瘀的作用。本实验通过观察放炎方对大鼠放射性肺损伤组织病理的影响，并检测其血清TGF-β1、IL-6含量，明确放炎方可能的作用机制，为该药的临床使用提供科学依据。

1 材料与试剂

1.1 动物与细胞株

大鼠，SPF级，(180±20)g，108只，购自湖南长沙斯莱克实验动物中心，合格证号：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 主要试剂与仪器

TGF-β1(武汉华美生物工程有限公司，批号：M22037282)，IL-6(武汉华美生物工程有限公司，批号：M20037293)；高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：H1650R)；切片机(浙江金华益迪医疗设备有限公司，型号：YD-315)；包埋机(常州中威电子仪器有限公司，型号：BMJ-A)；全自动酶标洗板机(深圳市汇松科技发展有限公司，型号：PW-812)；多功能酶标分析仪(深圳市汇松科技发展有限公司，型号：MB-530)。

2 方法

2.1 放炎方制备

药物组成：丹参15 g、牡丹皮15 g、当归12 g、川芎9 g、红景天10 g、黄芪12 g、麦冬10 g、南沙参10 g、款冬花9 g、浙贝母10 g、鱼腥草15 g、桑白皮15 g、黄芩9 g、猪苓15 g、茯苓15 g、甘草5 g。药材购自湖南省中医药研究院附属医院中药房(颗粒剂，四川新绿药业)，按比例加入100 ℃纯净水，使生药浓度分别达到0.75 g/mL(低剂量组)、1.5 g/mL(中剂量组)、3 g/mL(高剂量组)，保存于4 ℃备用。地塞米松片购于湖南省中医药研究院附属医院(上海上药信谊药厂股份有限公司，批号：015200301，规格：0.75 mg/片，100片/盒)。

2.2 放射性肺损伤模型造模

将108只大鼠随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、放炎方低剂量组、放炎方中剂量组、放炎方高剂量组、阳性对照组，每组18只。空白组不进行放射线照射，其余大鼠于照射前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后以仰卧位固定于照射台上。调整照射野，上至大鼠前肢两腋窝中点连线，下至胸骨剑突水平，照射面积为4 cm×4 cm，用直线加速器进行全胸单次照射，400 cGy/min，总剂量为18 Gy。麻醉后注意保暖，待大鼠自然苏醒后，送回实验动物中心常规饲养。

2.3 分组与给药

大鼠均于放疗后第1天给药，每日1次，直至被处死。放炎方低、中、高剂量组：中剂量为成年人120 g/d的等效量，即10.8 g/kg，低剂量为5.4 g/kg，高剂量为21.6 g/kg，分别灌胃；阳性对照组采用地塞米松灌胃，剂量为1.04 mg/(kg·d)；空白对照组及模型组以等体积生理盐水灌胃。

2.4 常规观察

每天记录大鼠精神、活动、饮食、二便、咳嗽、咳痰、照射区域毛发脱落情况，每周测定体重。记录死亡大鼠数量。

2.5 肿瘤组织取材

大鼠饲养期间每周测定体重1次，照射后第2、4和6周为检测节点，在检测节点每组选取5只大鼠处死取材。取材时采用10%水合氯醛腹腔麻醉，剂量为0.3 mL/100 g，麻醉后固定在木板上，腹主动脉取血，血液样本在4 ℃、3 000 r/min条件下离心10 min，移液器小心吸取上清液，储存于-20 ℃冰箱。摘取右肺中叶，以4%多聚甲醛溶液固定。

2.6 肺组织病理学观察

将固定好的右肺中叶进行常规脱水、浸蜡、包埋、切片，行HE染色，显微镜下观察肺组织病理改变。

2.7 TGF-β1、IL-6检测

采用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中TGF-β1、IL-6表达水平，按试剂盒说明书操作。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 一般症状体征观察

空白对照组大鼠活动反应、皮肤色泽及食量均正常，且体重增加。模型组大鼠从照射第1周开始出现食量减少、皮毛倒翻、精神萎靡、活动减少、背毛渐渐枯槁无光泽表现，在第4周、6周均有1例大鼠死亡。放炎方高、中、低剂量组大鼠精神、食量、活动度、毛发光泽度均明显优于模型组，无明显消瘦，无死亡。地塞米松组大鼠组精神、食量、活动度欠佳，毛发光泽度欠佳，优于模型组，但形体消瘦，第5周死亡1只。

3.2 各组大鼠肺组织病理变化

空白组大鼠未见肺部炎症反应；各组大鼠均在第2周检测提示明显炎症反应。模型组大鼠第4周炎症反应及渗出最为显著，第6周炎症反应及渗出仍较明显；地塞米松组大鼠第4、6周炎症反应及渗出均明显轻于模型组，第6周肺部炎症得到明显控制，渗出得到吸收。放炎方高、中、低剂量组大鼠第4周开始放射性肺炎反应均较模型组明显减轻，服药6周后，各组大鼠肺部恢复情况均优于模型组，其中高剂量组疗效最优。详见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理变化情况

3.3 各组大鼠TGF-β1表达情况比较

各组大鼠TGF-β1水平均在第2周开始升高，第4周达高峰，第6周开始回落。与模型组比较，放炎方低、中、高剂量组及地塞米松组大鼠血清TGF-β1水平明显下降，差异具有显著统计学意义(P<0.01)；高剂量组大鼠第4、6周TGF-β1水平明显低于地塞米松组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3.4 各组大鼠IL-6表达情况比较

各组大鼠IL-6水平均在第2周开始升高，第4周达到高峰，第6周开始回落。与模型组比较，放炎方低、中、高剂量组及地塞米松组大鼠血清IL-6含量明显下降，差异具有显著统计学意义(P<0.01)；放炎方高剂量组大鼠第6周IL-6水平明显低于地塞米松组，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠IL-6表达情况比较

4 讨论

放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗的主要并发症之一，不仅会降低患者生活质量，还可能导致放射剂量及肺部受照范围受限，影响临床疗效[2]，发生率约为10%～30%[3]，一般发生在放疗结束后1～3个月。放射性肺纤维化是慢性放射性肺损伤的表现，一般发生于放疗结束后3～6个月，甚至更长时间。放射性肺损伤的防治一直是临床需要解决的问题。目前西医预防性药物主要包括细胞因子、含硫化合物和激素类药物，效果不甚理想，且常因伴随副反应而限制了临床使用与推广。因此寻找副反应小、疗效较好的抗辐射药物将有利于放射治疗临床疗效的提高，意义重大。

目前公认的放射性肺损伤的发生机制为细胞因子学说，细胞、细胞因子及酶类相互作用与制约，维持放射性肺损伤发生发展过程[4]。TGF-β1、IL-6是放射性肺损伤发生发展的核心因子。放射性治疗的前6个月，放疗产生的氧自由基可促进TGF-β1产生，放射治疗6个月以后，TGF-β1可激活成纤维细胞产生过多细胞外基质，促进肺纤维化[5-6]。王刚等[7]动态监测肺癌放疗患者血浆TGF-β1水平，并观察与放射性肺炎发生的关系，结果发现TGF-β1的动态变化与放射性肺损伤的发生及严重程度密切相关，TGF-β1可以作为预测因子。IL-6是一种急性反应期的炎性因子，在放射性肺损伤中水平升高。Aprin等[8]分析96例行三维适形放疗的非小细胞肺癌患者的血浆IL-6和IL-10水平，发现均在放疗开始后2周升高，而IL-6在放射性肺炎患者中升高尤其明显，血浆IL-6和IL-10水平可联合作为放射性损伤发生的预测因子。

放射性肺损伤急性期主要病理改变为炎性渗出，本研究发现放炎方各剂量组大鼠肺部病理改变均明显轻于模型组，第6周肺组织损伤已明显修复。放炎方各剂量组大鼠血清TGF-β1、IL-6水平在第2周明显升高，第4周达高峰，第6周开始回落，升高强度明显低于模型组，且高剂量组大鼠TGF-β1、IL-6水平明显低于地塞米松组，提示放炎方能降低TGF-β1、IL-6水平，减轻肺部炎症，减少渗出，促进肺组织修复。

根据临床表现，放射性肺损伤属于中医学“肺痿”“肺痹”“喘证”等范畴。放射性肺损伤的基本病机以阴伤、气虚为本，热毒、血瘀为标，属本虚标实之证，治宜清热养阴润肺、活血通经化瘀[9]。基于此治法，我科采用放炎方治疗放射性肺损伤获得较好临床疗效。放射性肺炎为急性病变，放炎方中丹参、川芎、牡丹皮、当归凉血活血散瘀治其标，丹参重用为君；南沙参、麦冬、黄芪养阴清肺治其本，为臣药；款冬花、浙川贝、桑白皮、鱼腥草、黄芩清肺化痰；茯苓、猪苓益气健脾利水渗湿；甘草调和诸药。全方共奏清热养阴润肺、活血通经化瘀之功效。目前已有研究[10-11]发现中医药具有抗辐射作用，如补益肺气类药人参、黄芪、红景天、冬虫夏草等，活血化瘀类中药当归、川芎、丹参、水蛭、莪术等。充分发挥中医药优势，减轻或抑制放疗副反应，中西医结合，减毒增效，将会造福更多患者。