细菌纤维素合成菌的筛选、鉴定及其产物结构和性质表征

李婷婷，赵 鑫，任叶琳，任佳楠，韩雪容*

（长春理工大学 生命科学技术学院，吉林 长春 130022）

细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是微生物生产的类似于纤维素的由D-吡喃葡萄糖单体以β-1,4-糖苷键聚合而成的胞外直链高分子多糖；该多糖由直径3～4 nm的微纤维组成40～60 nm纤维束交织形成超精细3D纳米网状结构[1]。细菌纤维素这种独特高分子结构和超细3D纳米结构[2]，使其具有高持水能力[3]、高聚合度[4]、高机械强度[5]、高结晶度[6]等优异性能。如细菌纤维素膜抗撕拉能力是等厚度聚乙烯膜、聚氯乙烯膜的6倍[7]；其高吸水持水能力，经100 ℃干燥后的再溶胀能力与短棉绒相当[8]；其聚合度和结晶度均高于大多数植物纤维，具有更稳定的物理力学和热学性质[9]；另外，细菌纤维素还具有生物相容性、生物可降解性，可以将其用于伤口敷料以及组织工程支架的开发[10]，是一种新型环境友好型生物材料。目前，细菌纤维素作为诸多传统合成材料的代替品，在生物医学、造纸、化妆品、环境污染治理以及食品制造等多个领域具有广阔的应用前景[11]。

细菌纤维素自1886年BROWN A J[12]首次报道以来，因其优异的材料性能越来越受到广泛关注，尤其是在细菌纤维素合成菌株筛选、鉴定[5]，细菌纤维素合成机理及调控机制[10]，细菌纤维素发酵工艺优化生产[13]，细菌纤维素表面改性[14]等方面研究报道较多。然而，目前细菌纤维素由于生产菌种单一、合成产率低、合成碳源成本高等原因，仍难以满足应用市场对细菌纤维素材料的需求[15-16]。

为解决以上问题，本研究以含糖量较多的腐败葡萄为筛选源，筛选、分离鉴定高产细菌纤维素菌株，并通过扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）、傅立叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FT-IR）、凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）、X-射线衍射（X-ray diffraction，XRD）等观察、分析测试手段鉴定获得菌株合成膜的微观结构、分子表面的官能团特性、分子质量分布特征以及结晶度等，为后续细菌纤维素的规模发酵生产研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种来源

腐败葡萄（产地：中国新疆）：市售。

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉（均为生化试剂）：英国OXOID公司；葡萄糖、十二水合磷酸一氢钠、氯化铵、氢氧化钠、无水乙醇、五氧化二磷、硫酸、硝酸、碳酸钠、二甲基亚砜（均为分析纯）：北京化工厂；荧光增白剂：美国Sigma公司；柠檬酸（分析纯）：上海源叶生物公司；五氧化二磷（分析纯）：上海阿拉丁（Aladdin）公司。

1.1.3 培养基

富集培养基采用马血清（horse serum，HS）液体培养基：葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO42.7 g/L，柠檬酸1.15 g/L，蒸馏水；灭菌条件为120 ℃，20 min。

HS平板筛选培养基：HS液体培养基中加入1～3 μg/mL荧光增白剂和15 g/L琼脂粉。

1.2 仪器与设备

FB224电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；ZHJH-C1109B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器、HPX-9162MBE电热恒温培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；DW-86L626立式超低温保存箱：海尔集团；BOX EF-E凝胶成像系统：香港基因有限公司；JY-ECP3000电泳仪北京君意东方电泳设备有限公司；Life Touch TC-96/G/H聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：杭州博日科技股份有限公司；5424R高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司；DMXY系列光学显微镜：宁波舜宇仪器有限公司；Sigma500场发射扫描电镜：德国蔡司公司；L1600400傅立叶红外光谱仪、Bruker D8 X射线衍射仪：德国Bruker（布鲁克）公司；Waters1515凝胶渗透色谱仪：美国Waters公司。

2.2.3 缺乏有效的护患沟通和知识宣教。护士未落实责任制整体护理,往往重视患者的病情,而忽视了对患者的相关知识宣教和心理评估。长期置管患者对管道的自我管理警惕性下降,7例患者中2例T管脱出均是来院拔管的患者。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株筛选

将腐败葡萄放入HS液体培养基（30 mL）中，30 ℃静置培养1～3 d，选用液体表面产生纤维素凝胶膜的发酵液保存待用。

1.3.2 菌株分离纯化

取上述从膜上挤压的发酵液进行浓度梯度稀释后（10-2、10-4、10-6、10-8、10-10），用各浓度梯度的稀释液100 μL分别在平板筛选培养基上进行涂布，30 ℃静置培养16～24 h，挑取在紫外灯下发荧光的单菌落接种到富集培养液中再次富集培养。重复进行上述操作6次，至平板筛选培养基上呈现形态一致的单菌落。

1.3.3 菌株特征观察

菌落形态观察：观察记录培养3～5 d的筛选平板培养基中的菌落形态，包括菌落色泽、形状、大小、透明度等。

革兰氏染色：滴一小滴蒸馏水于干净的载玻片上，按无菌操作法用接种环取少许菌体，涂于水滴内并做好标记，涂匀，干燥，加热固定；待涂片冷却后，先滴加结晶紫染色1 min，用水冲去染液，沥干，再滴加碘液媒染1 min，去碘液，水洗；以体积分数95%的乙醇脱色20～30 s，水洗，最后滴加番红复染2～3 min，水洗，干燥，镜检[17]。

生理生化特征：进行接触酶、乙醇氧化成酸[18]、乳酸盐氧化成CO2和H2O[19]、乙酸盐氧化成CO2和H2O[20]、甘油转酮、葡萄糖生酮、丙二酸利用[21]、D-山梨醇产酸、麦芽糖产酸、甘露醇产酸、阿拉伯糖利用、Frateu's Hoyer的生长等项目的检测[22]。具体操作参照《伯杰系统细菌学手册》。

1.3.4 菌株生物学分类

筛选菌株的16S rDNA扩增：利用该菌株的基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）为模版，细菌16SrDNA通用引物1492 R：5'-GGTTAC CTTGTT ACGACT T-3'，27F：5'-AGAGTT TGATCC TGGCTC AG-3'，通过PCR反应扩增菌株的16S rDNA。扩增程序：94 ℃、5 min，94 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃、1 min，72 ℃、7 min，循环数30。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测、回收并纯化PCR样品送至吉林库美公司进行测序。将该菌株16S rDNA提交到美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）与其他细菌进行比较，用MEGA 6.0软件构建其分子系统进化树，确定该菌株具体生物学分类。

1.3.5 合成物结构表征

菌株的培养及合成物提取：扩大培养规模至100 mL，在30 ℃、7～10 d培养后，取产生的菌膜经蒸馏水多次冲洗至菌膜表面无杂物及培养基后，将其置于0.5%的NaOH溶液中，放入100 ℃烘箱中处理2 h，待其冷却后再用蒸馏水多次冲洗至呈中性，沥干水分并进行冻干处理后得到干膜。

检测分析：扫描电镜观察（SEM）、吸水性、红外光谱检测（FT-IR）、凝胶渗透色谱（GPC）、X射线衍射（XRD）等。

2 结果与分析

2.1 筛选纯化结果

以腐败葡萄作为筛选源，经6次平板涂布筛选得到一株细菌纤维素合成菌，将其命名为菌株ZX C6-15。

2.2 菌株特征

2.2.1 菌落形态学观察

由图1A可知，菌株ZX C6-15单菌落呈乳白色、圆形、略微隆起、表面光滑、不产色素、产酸。由图1B可知，经革兰氏染色制片后光学显微镜（10×100）下看到该菌呈短杆状、单个或成对，颜色反应呈红色，说明ZX C6-15菌株为革兰氏阴性菌。由图1C可知，在紫外灯下发荧光、菌落直径大约为0.5 mm。

图1 菌株ZX C6-15菌落形态（A）、细胞形态（B）及紫外观察结果（C）Fig.1 Colony morphology (A),cell morphology (B) and ultraviolet observation results (C) of strain ZX C6-15

2.2.2 生理生化检测

对菌株ZX C6-15进行生理生化特征检测结果见表1。由表1可知，该菌株与醋酸菌类似，对接触酶、阿拉伯糖利用、乙醇氧化成酸、甘油转酮、葡萄糖生酮等反应结果呈阳性，乳酸盐氧化成CO2和H2O、乙酸盐氧化成CO2和H2O、丙二酸利用、D-山梨醇产酸、麦芽糖产酸、甘露醇产酸、Frateu's Hoyer的生长等反应结果呈阴性。

表1 菌株ZX C6-15的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain ZX C6-15

2.3 菌株生物学分类结果

菌株ZX C6-15的16S rDNA序列全长为1 362 bp，分子系统进化树见图2。由图2可知，菌株ZX C6-15与Acetobacter syzygiistrain SZCPY4：KU555381.1相似性达到100%，属于醋酸菌属，因此将其鉴定为醋酸菌属（Acetobactersp.）ZX C6-15（NCBI登录号为：MT355921.1）。

图2 基于16S rDNA基因序列菌株ZX C6-15系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZX C6-15 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 菌株ZX C6-15产膜的结构和性质表征

2.4.1 SEM观察

由图3可知，Acetobactersp.ZX C6-15菌株产膜的扫描电镜图中，菌膜表面有少许残留物，纤维细而长，微纤维互相交叉、缠绕、折叠形成密集网状结构，这种超微纤维网结构决定了细菌纤维素的高持水性。产物扫描电镜结果与文献[23]中的细菌纤维素结构类似。

图3 醋酸菌ZX C6-15产膜的扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscopy image of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.2 吸水率检测

菌株Acetobactersp.ZX C6-15产膜干燥后膜的吸水率测定结果见表2。

表2 醋酸菌ZX C6-15产膜的吸水率测定结果Table 2 Determination results of water absorption rate of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

由表2可知，该菌产膜的吸水率高于细菌纤维素模式菌株ATCC23769的吸水率，达到298%。结果表明，该菌株提取的产物具有良好的吸水性能，取决于产物具有的网状纳米纤维结构。

2.4.3 FT-IR检测

菌株Acetobactersp.ZX C6-15合成的样品进行红外光谱检测结果见图4。由图4可知，波数3 352 cm-1处峰型宽且较强的为O-H键吸收峰；波数2 918 cm-1处为C-H键吸收峰；波数1 625 cm-1处为纤维素4'端半缩醛基吸收峰；波数1 159 cm-1处为C-O键吸收峰，与模式菌ATCC23769产ATCC-BC所含有的官能团基本吻合，也与MACHADO R T A等[24]的研究结果相符。结果表明，Acetobactersp.ZX C6-15菌株产生膜是细菌纤维素。

图4 醋酸菌ZX C6-15产膜的红外光谱图Fig.4 FT-IR spectrum of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.4 凝胶渗透色谱检测

Acetobactersp.ZX C6-15菌株产膜Aceto-BC样品和模式菌株ATCC23769产膜ATCC-BC样品进行GPC检测。将细菌纤维素样品于硝酸和硫酸混酸溶液中硝化后，蒸馏水洗涤数遍，使用5%碳酸钠溶液浸泡中和后，蒸馏水煮沸30 min。将样品取出，使用无水乙醇浸泡1 h后过夜烘干。取适量处理后的细菌纤维素样品溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中进行检测，分子质量标准品为聚甲基丙烯酸酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA），检测结果见表3。由表3可知，菌株ZXC6-15产膜的重均分子质量（Mw）为14.1×104kDa，数均分子质量（Mn）为32.3×104kDa，分散度为2.28。对比细菌纤维素模式菌ATCC23769的产物，重均分子质量增加，分散度降低，表明该菌株合成的细菌纤维素的聚合度更高，平均粒径尺度更均匀。

表3 醋酸菌ZX C6-15菌株产膜的分子质量分析Table 3 Molecular mass analysis of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.4.5 X射线衍射检测

菌株Acetobactersp.ZX C6-15产膜样品Aceto-BC和ATCC-BC进行XRD检测，结果见图5。由图5可知，在2θ=14.64°，16.48°和22.74°处出现三个主要特征峰，分别对应于Ⅰ型纤维素的（1-10），（110）和（200）晶面[25]，表明Aceto-BC属于纤维素Ⅰ型晶体结构。经计算，Aceto-BC的结晶度指数为96%，高于ATCC-BC的结晶度指数82%。生物高分子的结晶度决定其纤维的形态、材料的分解温度、拉伸强度等材料性能[26]，该细菌纤维素具有如此高的结晶度表明其具有良好材料性质。

图5 醋酸菌ZX C6-15产膜的X射线衍射图Fig.5 X-ray diffraction spectrum of membrane produced by Acetobacter sp.ZX C6-15

2.5 讨论

本研究从水果中分离、纯化得到能产膜的菌株ZX C6-15的生理生化分析结果表明该菌株具有接触酶和甘油转酮活性，但不具有甘露醇产酸、丙二酸利用以及麦芽糖产酸活性，说明菌株ZX C6-15与产酸的醋酸菌区别较大[27-28]。本研究得到的菌株ZX C6-15尽管与Acetobacter syzygiiSZCPY4具有很高的同源性，但可能是合成细菌纤维素的属于醋杆菌的较新菌种。采用SEM、FT-IR、XRD、GPC等检测手段对该菌株产膜的分析结果表明，该膜与模式菌株ATCC23769所产细菌纤维素类似，具有比模式菌纤维更致密的3D网状结构，且具有细菌纤维素典型基团的特征吸收峰。对比模式菌株ATCC23769所产细菌纤维素，菌株ZX C6-15合成细菌纤维素数均分子质量、分散度、结晶度和吸水率更高，表明该细菌纤维素的分子质量的均度更好，具有更优秀的材料性质。

3 结论

本研究以腐败葡萄作为筛选源，经筛选、分离纯化得到一株能够合成细菌纤维素且传代稳定性良好的菌株；该菌株可能属于醋酸菌属的较新菌种，命名为Acetobactersp.ZX C6-15；对比细菌纤维素模式菌ATCC23769，该菌株合成产物具有更致密的典型细菌纤维素3D纳米网状结构和分子官能团吸收；合成产物细菌纤维素的重均分子质量为14.1×104kDa，分散度为2.28，结晶度为96%，吸水率为218%，均高于模式菌ATCC23769生产的细菌纤维素，表明Aceto-bactersp.ZX C6-15所产细菌纤维素具有优良的理化性质和机械性能。