银杏内生链格孢菌培养条件初探*

庄 华

（1.陕西省土地工程建设集团有限责任公司，陕西 西安 710075；2.陕西省土地工程技术研究院有限责任公司，陕西 西安710021；3.自然资源部退化及未利用土地整治工程重点实验室，陕西 西安 710075；4.陕西省土地整治工程技术研究中心，陕西 西安 710075；5.陕西地建土地工程质量检测有限责任公司，陕西 西安 710082）

植物内生真菌是与植物组织共生的一类真菌，它们可以产生与宿主类似的且具有生理活性的代谢产物[1]。近年来随着银杏栽培规模扩大，银杏叶部病害的发生日趋严重，而内生链格孢菌是银杏叶部重要的内生真菌之一[2-3]。本实验初步探索不同营养、光照、pH值等培养条件下对链格孢菌菌丝生长和产孢量的影响，为进一步研究银杏链格孢菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

银杏链格孢菌来自本实验室，实验前进行活化[4-5]。

1.1.2 供试植物

小麦、青稞、十大功劳和银杏新鲜叶片。

1.1.3 PSA培养基

按文献[3-4]的方法配制：胡萝卜（去皮）200g，蔗糖20g，琼脂20g，水1000mL。具体制作方法是：将200g胡萝卜切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30min左右至胡萝卜软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管中。

1.2 方法

1.2.1 接种培养及菌饼的制作

按文献[4-5]的方法进行。在恒温培养箱25℃培养60h～72h。当菌丝体布满培养皿后，在无菌条件下取直径为7mm菌饼。

1.2.2 含不同植物叶片汁液的培养基制备及其对菌落生长的影响测定

分别称取3-5g小麦、青稞、十大功劳和银杏的新鲜叶片，切碎对应放入500ml三角瓶中，再分别加入200ml蒸馏水，将三角瓶在微波炉加热煮沸约30min，待冷却后，用纱布过滤至三角瓶中，并称取琼脂粉3.5g，摇匀后加热至琼脂完全溶后定容，用三角瓶分成2份，一份加庶糖2g为一组，一份为不加蔗糖为一组。分别将菌饼接种到制备的2种不同处理培养基中，每组做6个重复，放置在25℃培养箱中培养72h后，量取菌落直径并计算菌丝生长速率[4]观察并记录菌落生长。

1.2.3 不同光照条件设定及对菌丝生长和孢子萌发的影响测定

接种的菌饼分别在直射光下、散射光下、黑暗条件下25℃培养，48h后量取菌落直径，每组做6个重复。凹玻片悬滴法检测孢子萌发：用无菌水将培养物制成孢子悬浮液，在XSP-2CB双模显微镜（10×10）下观察孢子浓度后，放置在25℃培养箱中，相对湿度90%-100%的条件下培养12h后统计分生孢子的萌发率，每组做6个重复。

1.2.4 不同pH值培养基制备及对菌丝生长和孢子萌发的影响测定

PSA培养基灭菌后待60℃-70℃时，测量其pH值后，相应的用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH溶液调pH梯度分别为2～13，迅速倒皿，待其凝固后把菌饼分别接到制备的不同pH值培养基上，在25℃下培养72h后测量并记录菌落直径，每组做6个重复。按1.2.3中配制孢子悬浮液，pH调节到2～13的不同pH值梯度，采用凹玻片悬滴法，将培养物放在25℃培养箱中培养12h，统计分生孢子的萌发率，每组做6个重复。

2 结果与分析

2.1 含不同植物叶片汁液的培养基对菌丝生长和产孢的影响

含不同植物叶片汁液培养基培养的银杏链格孢菌的生长特性见表1。实验发现没有加糖处理的菌落生长表现为菌丝体稀疏,同时，菌落的直径偏小且产孢量也较少，而加糖的菌丝密度呈现出密集状态,表现为絮状。显而易见，糖分对链格孢菌菌丝体生长及分生孢子的产生具有促进作用。从表1结果可知,以含小麦、青稞、十大功劳等植物叶片汁液培养基的生长较差,而含银杏叶片汁液培养基的生长情况明显比前面几种植物好，这也说明该菌在银杏中寄生更加适合，由此说明，银杏链格孢菌对培养基中不同营养成分具有一定的选择性或适应性。

表1 链格孢菌在含不同植物叶片汁液培养基上的生长特性

2.2 不同光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响

不同光照条件下处理后，菌丝体在散射光、黑暗条件下生长及孢子萌发优于直射光处理。日平均生长速率和分生孢子萌发率结果见表2、表3。

表2 菌丝体在不同光照条件下的日平均生长速率

表3 分生孢子在不同光照条件下的萌发率

2.3 不同pH值对菌丝生长和孢子萌发的影响

pH值在5～9范围时，菌丝体生长表现最适宜，当pH值为5时生长明显增快，70～72h后菌落直径42.5～47.3mm，全皿可见；当pH值为2时，发现只有在菌饼上有菌落。当pH值为10～12范围时，菌丝生长较缓慢，72h后迅速生长，试验结果见表4。

表4 菌丝体在不同pH值下的生长速率及孢子萌发率

3 讨论

研究发现不同的培养条件对银杏链格孢菌菌丝生长及孢子萌发有着很大差异，温度、湿度和光照等培养条件影响其生长和繁殖[6-8]，菌丝体生长速率及孢子萌发率在直射光条件下弱于在散射光和黑暗条件下，这可能是菌丝体在生长过程中直射光光源太强，抑制了菌丝体的生长。同时，有学者研究发现内生真菌可能会产生酸性代谢产物而降低了培养基的pH值[9-10]。含不同植物的汁液培养基对银杏链格孢菌的生长明显有差异，但都能产生菌丝体，说明银杏链格孢菌的营养范围比较广泛。了解内生真菌的基本生长特性很有必要，本研究旨在为进一步研究银杏链格孢菌奠定基础。同时，为深入挖掘内生真菌的资源利用提供重要技术支撑。