产芽孢乳酸菌Lsp-1 的抗逆性及产酸产消化酶能力分析

马林峰，武朝霞，陈丽琴，冀霞，张慧琴，韩克光，古少鹏，霍乃蕊

（山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷030801）

畜禽养殖过程中，微生物饲料添加剂具有增强免疫力、抑制病原菌、无残留、无抗药性、促生长、安全无副作用等诸多优点，逐渐成为抗生素的理想替代［1，2］。利用益生菌是一种经济有效的消炎疗法［2～4］，近年来主要用于结肠炎［3，4］、炎性肠病［2，5］等炎性疾病以及过敏性疾病［6～8］的治疗。

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，L. a）是最常见的一种益生菌［9］，自然存在于哺乳动物口腔、肠道和生殖道黏膜表面［10］，是我国可用于婴幼儿食品以及保健食品的菌种，也是农业部规定的可用于饲料添加的安全菌种。L. a在乳酸菌家族中极受重视，因其耐酸性强，能在其它乳酸菌不能生长的低pH、高胆盐胃肠环境中存活而被誉为第三代酸奶发酵剂菌种［11］，通过合成乳酸、抗菌素等发挥多种益生功能，并在体内通过调节Treg-Th17 细胞平衡而对T 细胞介导的炎性疾病具有免疫调节［8，12］、改善骨质的作用［9］。

乳酸菌，即使是嗜酸乳杆菌，在定植肠道之前大部分菌体会失活，而芽孢是抗逆性最强的生命形式，所以产芽孢乳酸菌的分离筛选及育种始终是研究的热点。细胞融合是一种安全的定向微生物育种方法，将嗜酸乳杆菌与产芽孢菌融合是获得产芽孢乳杆菌的一条有效途径，并且融合子将整合两亲本菌株的优良性状。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，B. lich）也是农业部《饲料添加剂品种目录》规定的安全菌种，其抗逆性强，并且产消化酶的能力也强，是重要的整肠生菌种，可替代抗生素用于养殖动物肠道疾病的治疗。

本研究将探讨嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌融合形成的芽孢乳杆菌Lsp-1 的耐酸耐胆盐能力、产酸能力、产丁二酮能力、产蛋白酶和淀粉酶能力以及胆固醇清除能力，探讨细胞融合对上述能力的影响，为Lsp-1 在畜牧养殖、疾病治疗、微生态制剂生产、饲料青贮、饲料添加剂、环境治污、生物有机肥等领域的应用提供理论依据，也为芽孢乳酸菌育种提供新的可行方法。

1 材料和方法

1.1 菌株

芽孢乳杆菌Lsp-1 为遗传稳定的地衣芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的融合子，由山西农业大学动物医学学院卫检实验室专利方法育种而成［13］；嗜酸乳杆菌CICC 20248 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；地衣芽孢杆菌BL20386 无毒菌株从整肠生胶囊中分离纯化。

1.2 耐酸耐胆盐能力测定

取对数生长期L. a、B. lich和Lsp-1 的菌液各1 mL，离心并洗涤菌体（3 000 r·min-1，5 min），生理盐水重悬，分成4 等份，每份加入1 mL pH 2.0 的MRS 培养基混匀，第1 份直接活菌计数，其余3 份分别37 ℃静置培养1.5、2.0、2.5 h 后计数。计数时取10-6，10-7，10-8共3 个稀释度，每个稀释度3 皿，培养基为pH 6.5 的MRS 固体培养基，37 ℃恒温培养2 d 后进行菌落计数。耐胆盐能力测定操作同上，只是将pH 2.0 的MRS 培养基换成牛胆盐浓度为0.3%的MRS 培养基。存活率按式（1）计算。

1.3 产乳酸能力分析

取活化好的L. a及Lsp-1 培养液，以5%（V∶V）的接种量接种于10 mL MRS 液体培养基（pH 6.5）的试管中，37 ℃恒温振荡培养，10 h 时各取一支试管滴加溴甲酚紫指示剂，根据指示剂变色情况进行定性分析；另每隔12 h 取3 支试管，以NaOH 滴定法测定并按式（2）计算产乳酸量，式中V 表示消耗的氢氧化钠的体积（mL）；90.08 代表乳酸的摩尔质量［14］。

1.4 产蛋白酶能力分析

制备粗酶液：将活化的对数生长期菌液以体积 比3% 接 种 至MRS 改 良 酪 蛋 白 培 养 基 中［14］，37 ℃培养16 h 后，离心（4 200 r·min-1，15 min），上清液即胞外粗酶液。制备胞内粗酶液时，离心收集菌体并用与原培养液等体积的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 3.6，测酸性蛋白酶）或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 7.2，测中性蛋白酶）重悬菌体并超声破碎处理（功率200 W，200 次，每次3 s，间隔3 s），离心收集上清液。

制作酪氨酸标准曲线：配置浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg·mL-1的酪氨酸溶液，各取1 mL于6 支试管，每管加入0.4 mol·L-1碳酸钠5 mL 和2 倍稀释的福林试剂1 mL，40 ℃发色20 min 后测OD660值。以各管OD660减去1 号管OD660所得的净OD660为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标，制作标准曲线。

酶活测定：取试管2 支，各加粗酶液1 mL，40 ℃预热2 min，加入预热的2% 酪蛋白溶液1 mL，40 ℃10 min，立即 加入0.4 mol·L-1三氯乙酸2 mL 终止反应，水浴中保温20 min，离心取上清，吸取1 mL 分别加入3 支试管，再加入碳酸钠溶液和福林试剂，操作同标准曲线制作。空白管在加酪蛋白之前先加0.4 mol·L-1三氯乙酸2 mL 酶灭活，其余操作同粗酶液。

在40 ℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需的酶量，定义为1 个蛋白酶活力单位，按式（3）计算，式中A 为样品净OD660值对应标准曲线的酪氨酸微克数；N 为粗酶液稀释倍数；4 表示4 mL 反应液取出1 mL 测定；10 表示反应10 min。

1.5 产淀粉酶能力分析

各菌株活化后以牙签点种法接种于淀粉琼脂平板上，37 ℃培养24 h，用碘熏蒸显色，测定水解透明圈直径（H）与菌落直径（C），计算H·C-1值。

1.6 产丁二酮能力分析

15 μL 丁二酮标准液用蒸馏水定容至500 mL，分别吸取0、2、4、6、8、10 mL 于6 支试管，蒸馏水补足至10 mL，各管吸取5 mL 加入8%三氯乙酸溶液，配置成浓度分别为0、3、6、9、12、15 μL·mL-1的丁二酮溶液。另取6 支试管做空白管，操作同上。每管再加入1%邻苯二胺溶液0.5 mL，空白管不加，摇匀后黑暗处反应30 min 后，反应管和空白管分别加2.0、2.5、4.0 mol·L-1盐酸终止反应，以相应的空白管作参比，在波长335 nm 处测吸光度值。以丁二酮浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制作标准曲线。

各菌株以0.5%接种量接种于MRS 培养12 h后，用三氯乙酸沉淀蛋白，离心取上清，加1%邻苯二胺避光反应30 min，加4.0 mol·L-1盐酸终止，紫外分光光度计测定OD335，根据标准曲线求得丁二酮含量。

1.7 胆固醇清除率测定

分别吸取4 mL 胆固醇浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·L-1的冰乙酸溶液于6 支具塞试管中，加入2 mL 铁矾显色液，混匀后于560 nm处测OD 值，绘制胆固醇标准曲线。将各菌株等量接种于含1 g·L-1胆固醇的MRS 培养基中，培养60 h，吸取0.2 mL 加入冰乙酸4.8 mL，室温孵育10 min，离心取上清，加入2 mL 铁矾显色液，立即摇匀冷却到室温，测OD560值，根据标准曲线求得胆固醇含量，按式（4）计算胆固醇清除率，式中A 代表各试验菌株培养液上清的OD560，B 代表空白对照（未接种培养液）的OD560。

1.8 数据统计与分析

数据利用SPSS 19.0 软件进行方差分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 耐酸耐胆盐能力

由表1 可见，各菌株的存活率随着处理时间的延长而降低，培养1.5 h 后，嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和融合子Lsp-1 的存活率分别为6.62%、3.12%和6.15%，可见地衣芽孢杆菌的营养体形式最不耐酸，嗜酸乳杆菌的耐酸能力最强，营养体形式的Lsp-1 的存活率大大高于地衣芽孢杆菌，接近于嗜酸乳杆菌。在选择性培养基中培养2.0 h和2.5 h 后，Lsp-1 的 存活数比L.a和B.lich多1 个数量级，综合分析，Lsp-1 的耐酸能力比亲本菌株的都强。

表1 各菌株在pH=2.0 选择培养基培养不同时间后的存活数Table 1 The viable count of bacteria cultured in selective medium（pH=2.0）at different intervals

由表2 可见，各菌株活菌数的起始数量级均为108，在含0.3%胆盐的培养基中处理1.5 h 后，嗜酸乳杆菌的活菌数降低的最快，数量级由108降低到106。处理2 h 后，Lsp-1 依然保持在数量级107，而嗜酸乳杆菌与地衣芽孢杆菌分别降低了3 个和2 个数量级，处理2.5 h 后，Lsp-1 的存活数高出两亲本菌株1 到2 个数量级，说明Lsp-1 的耐胆盐能力均比两亲本菌株较高。

2.2 产乳酸能力

乳酸是常见的抑菌物质，具有抑制肠道病原菌生长，促进有益菌增殖的益生作用［15］。由图1A 可见，Lsp-1 遗传了地衣芽孢杆菌的芽孢生成能力，可观察到被孔雀绿绿染的位于菌体中央的芽孢囊和成熟游离的芽孢；图1B 中，地衣芽孢杆菌（1、2 管）几乎不变色，Lsp-1（3、4 管）与嗜酸乳杆菌（5、6 管）的培养液使溴甲酚紫明显变黄。

进一步比较嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的产酸能力，由图2 可见，在培养前期，Lsp-1 的产酸速率稍低于嗜酸乳杆菌，随着培养时间的延长，48 h 二者产酸量基本相同，且达到峰值（10.52 g·L-1），说明亲本嗜酸乳杆菌的产酸能力经过细胞融合后在LSP-1 中没有丢失或下降。

表2 各菌株在胆盐浓度0.3%的选择培养基中培养不同时间后的存活数Table 2 The viable count of bacteria in selective medium containing 0.3 % bile salt at different intervals

图1 Lsp-1 孔雀石绿染色镜检及三株菌的产酸鉴定Fig.1 Microscopy of Lsp-1 stained by malachite and the acid-producing identification of 3 strains

图2 嗜酸乳杆菌及产芽孢乳杆菌Lsp-1 的产乳酸曲线Fig.2 Lactic acid-producing curve of L.acidophilus and Lsp-1

2.3 产蛋白酶能力

胞内蛋白酶与细胞的催化和调节作用有关；胞外蛋白酶则分泌至细胞外作用，降解胞外的氮源或能源物质。酸性蛋白酶适合在酸性条件（pH值1.0～5.0）下水解蛋白质，最适pH 为2.5～5.0；中性蛋白酶的最适作用pH 则介于6.0～7.5。酪氨酸标准曲线回归方程为Y=94.91X+1.405 9，R2=0.999 3，线性关系良好。由表3 可见，产胞外蛋白酶和胞内蛋白酶能力均是：地衣芽孢杆菌＞Lsp-1＞嗜酸乳杆菌，并且各菌株产胞外中性蛋白酶能力大于产酸性蛋白酶能力，胞内酶则相反，各菌株产酸性蛋白酶能力高于产中性蛋白酶能力。可见，Lsp-1 的产蛋白酶能力介于两亲本菌株之间，各菌株所产胞外酶主要是中性蛋白酶，胞内酶主要是酸性蛋白酶。

2.4 产淀粉酶能力

由表4 可见，3 菌株都产淀粉酶，其中地衣芽孢杆菌的透明圈直径与菌落直径比最大，嗜酸乳杆菌最小，Lsp-1 介于二者之间（图3）。

2.5 产丁二酮能力

丁二酮在食品、化工等领域应用广泛［16］，由糖降解产生［17］，具有浓郁的奶香风味，是发酵乳制品重要的特征性风味物质。丁二酮质量浓度与OD335的线性回归方程为Y=0.069 5X+0.005 8，R2=0.999 9。在相同培养条件下，培养液中的丁二酮浓度嗜酸乳杆菌为10.25 μg·mg-1，Lsp-1 为8.21 μg·mg-1，地衣芽孢杆菌则没有检测到。

2.6 胆固醇清除率

胆固醇标准曲线回归方程为Y=1.368 8X+0.005 6，R2=0.999 7，线性关系良好，胆固醇含量与吸光度值OD560呈正相关。由图4 可见，L. a（15.2%）和B. lich（8.9%）均有胆固醇清除能力，但由二者融合所得的Lsp-1，其胆固醇清除能力最高（19.7%），显著高于两亲本菌株（P＜0.05）。

表3 各菌株的胞内蛋白酶和胞外蛋白酶产量Table 3 Intracellular and extracellular protease produced by different strains 单位：U·mL-1

表4 融合子及亲本菌株的产淀粉酶能力比较Table 4 Amylase-producing ability of parent strains and the fusant

图3 地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、Lsp-1 产淀粉酶能力比较Fig.3 Comparison of amylase production ability of B.lich，L.a and Lsp-1

图4 各菌株的胆固醇清除率Fig.4 Cholesterol scavenging rate of each strain

3 讨论

原生质体融合技术与基因工程技术不同，发生重组的不是单个基因而是整个基因组，是全基因组水平的分子定向进化，类似于有性繁殖，实现双亲本之间的基因信息交流，是一种快速提高细胞表型的全基因组工程方法［18］。本研究通过原生质体融合（细胞融合）赋予嗜酸乳杆菌芽孢生成能力的另一亲本菌株——地衣芽孢杆菌，也具有增强机体免疫、维持肠道微生态环境、促进动物生长等多种益生功能［19］。地衣芽孢杆菌进入肠道后，通过三重机制抑制病原菌，恢复肠道功能：一是通过生物夺氧，创造对双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌和正常生理厌氧菌有利的低氧环境而促进其生长繁殖，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH，间接抑制其它致病菌生长；二是促进机体产生抗菌物质，拮抗白色念珠菌（Candida albicans）、葡萄球菌（Staphylococcus）等致病菌的活动；三是通过固本，增强机体的特异性和非特异性免疫，提高养殖动物的抗感染能力。用作饲料添加，对养殖动物肠道细菌感染具有特效，对急性肠炎和急性菌痢疗效明显，使地衣芽孢杆菌自然成为替代抗生素的一种理想选择，有关Lsp-1 的体内外抑菌和动物饲喂试验将另文报道。

Lsp-1 遗传了地衣芽孢杆菌的产芽孢能力，赋予其在复杂的胃肠道环境中可顺利到达肠道的能力［15］，Lsp-1 芽孢能耐受人工模拟胃液和肠液，在胃液中部分萌发成营养体形式［20］，本研究表明Lsp-1 营养体的耐酸耐胆盐能力通过细胞融合产生了叠加效应，均高于两亲本菌株，正好为其提供保护，提高过胃能力和存活率，这是任何益生菌或微生态制剂发挥作用的先决条件。同时本研究表明Lsp-1 遗传了嗜酸乳杆菌的产乳酸能力，乳酸是无毒、低成本的多用途化学品，作为添加剂可以控制堆肥过程中的氨气排放［21］。

产酶性能也是考察优良微生态制剂菌种的一个重要方面，微生物胞外酶可补充动物源性酶的不足［19］，降解难以被吸收或利用的大分子物质，利于提高肠道吸收能力和饲料转化率，促进养殖动物生长，同时对益生菌生长形成正向反馈，建立良性循环。淀粉酶分解肠道中碳水化合物形成的寡糖，不仅易于吸收，同时也是乳酸菌的促生长因子（益生元）。蛋白酶将蛋白质及一些抗营养物质水解成肽、氨基酸等小分子物质，提高了蛋白质的可消化性和生物利用度，氨基酸等小分子水解产物又会被微生物吸收利用，促进微生物生长繁殖［22］。肠道环境适于中性蛋白酶作用，而Lsp-1 主要在肠道定植和发挥作用，并且Lsp-1 的产中性蛋白酶能力高于产酸性蛋白酶的能力。嗜酸乳杆菌产蛋白酶和淀粉酶的能力较弱，而地衣芽孢杆菌则很强，经过融合，Lsp-1 的产蛋白酶能力和产淀粉酶能力均不及亲本地衣芽孢杆菌的水平，没有产生叠加效应。

胆固醇清除能力也是益生菌的益生功能之一，本研究两亲本菌株的胆固醇清除能力在Lsp-1中产生了叠加效应。胆固醇对乳酸菌的生长具有抑制作用［23］，Lsp-1 可通过清除周围环境中的胆固醇来促进其自身及其它乳酸菌的生长。

4 结论

嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌的融合子Lsp-1兼具了两亲本菌株的优良特性，耐酸能力、耐胆盐能力以及胆固醇清除能力产生了叠加效应而进一步增强，产蛋白酶能力和产淀粉酶能力则介于两亲本菌株之间，产酸能力则与亲本菌株嗜酸乳杆菌持平。Lsp-1 用作饲料添加或微生态制剂制时的高胃肠存活率，为其益生功能的发挥提供了保障；产消化酶能力可提高饲料利用率，促进动物生长，形成的小分子物质也可正反馈作用于益生菌的生长。