苦荞叶黄酮对糖尿病小鼠的肝肾保护效果及机制

李涛，韩雪梅，许效群，韩克光*

（1.山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷030801；2.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷030801）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，长期存在的高血糖会导致各种组织受损，特别是造成眼、肝、肾、脾、心脏、血管、神经的慢性损害以及功能障碍。据国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation，IDF）公布：2015 年用于糖尿病医疗保健的支出高达6 730 亿美元；同年全球4.15 亿糖尿病成年患者及3.18 亿存在患糖尿病风险的人群中，中国占三分之一［1］。在我国糖尿病的发病率以每年100 万的速度增加［2］。目前主要通过药物控制血糖水平来减少高血糖对各组织器官的损伤，然而这些药物可引起不同程度的不良反应［2，3］。近年来，天然黄酮类化合物作为安全、有效的降糖降脂物质引起国内外学者的高度关注，但不同来源的天然黄酮其构成与功效不同。本课题组前期研究结果表明，盛花期的苦荞叶黄酮化合物含量高达10.25%，远高于苦荞籽粒及其它植物资源。提取的苦荞叶黄酮（Fagopyrum tataricumleaf flavone，FLF）可促进糖尿病模型小鼠胰岛β 细胞的修复，具有显著的降糖效果［4］，本研究将探讨FLF 在降糖过程中对糖尿病小鼠脏器病损的保护修复作用及机制，为苦荞叶黄酮及天然降糖物质的开发利用提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

FLF 由山西农业大学食品学院苦荞深加工研究课题组提供，由超声波萃取、大孔吸附树脂纯化而得，纯度为90%。链脲佐菌素为Sigma 产品，盐酸二甲双胍（Metformin Hydrochloride，Met）购自北京索莱宝，其余试剂均为国产分析纯。检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、胰岛素（INS）的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

高速电动匀浆器（天津恒奥），D-3752 高速冷冻离心机（美国Sigma），723 可见分光光度计（上海菁华）；DNM-9606 酶标分析仪（北京普朗）；RM2015 切片机（德国Leica）；多功能真彩色细胞图像分析管理系统（美国Media Cybernetics）。

1.3 糖尿病小鼠模型的建立、分组、处理及样品采集

清洁级ICR 雄性小鼠［（体质量20±2）g］购自山西医科大学动物实验中心［SCXK（晋）2015-0001］，通过高脂高糖饲料和腹腔注射链脲佐霉素（Streptozocin，STZ）建立糖尿病小鼠模型［4］，将建模成功的小鼠随机分为模型对照组（Model）、盐酸二甲双胍（Metformin hydrochloride）治疗组（Met150 mg·kg-1bw）和3 个FLF 干预组，每组10只，另取10 只健康小鼠作为正常对照组（Nomal）。FLF 的高、中、低3 个剂量组分别为FLF-H（200 m·kg-1bw）、FLF-M（150 mg·kg-1bw）和FLF-L（100 mg·kg-1bw）。所有小鼠均饲喂标准饲料，每日灌胃相应的受试物，N 组和M 组灌胃等体积生理盐水，期间测定小鼠体重，持续4 周后，脱颈处死小鼠，摘取肝脏和肾脏，称重后，部分组织用于制备石蜡切片，剩余部分制成10%组织匀浆液，离心取上清液，-20℃保存。

1.4 切片制作及染色

肝和肾的组织切块经10%甲醛溶液固定后制备组织石蜡切片，切片厚度为4 μm，附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，经二甲苯脱蜡处理和乙醇梯度脱水后，苏木素伊红染色，依次再经95%、100%乙醇、二甲苯∶石碳酸（3∶1）、二甲苯处理后，中性树脂封固，显微镜下观察。

1.5 脏器指数和抗氧化能力检测

各脏器指数为脏器湿重与体质量之比。严格按照试剂盒说明书测定小鼠肝脏、肾脏组织中的SOD、GSH-PX、MDA 含量。

1.6 统计分析

采用GraphPad Prism 5 软件分析数据，所用数据以（平均数±标准误）表示，组间采用t 检验进行分析。

表1 各组小鼠体重变化情况Table 1 Changes of mice body weight（g）in different groups during 4-week treatment 单位：g

2 结果与分析

2.1 FLF 对DM 小鼠体重的影响

由表1 可见，糖尿病模型小鼠和正常小鼠的体重在灌胃受试物之前无统计学差异（P＞0.05）；实验期间，N 组小鼠体重逐渐增加，M 组体重则不断下降，第5 天时，M 组体重便显著低于N 组（P＜0.05）。Met 组与FLF 高剂量组在给药第5 天，体重显著高于M 组（P＜0.05），中、低剂量组则分别在给药第9 天和第13 天显著高于M 组（P＜0.05）。给药第9 天直至实验结束，Met 和FLF 高剂量组的小鼠体重均极显著高于M 组（P＜0.01），以上结果说明FLF 可很好地改善糖尿病小鼠的体重下降情况，且呈一定的剂量效应。

2.2 FLF 对DM 小鼠肝肾脏器指数的影响

由图1 可见，M 组小鼠的肝脏、肾脏指数显著高于N 组（P＜0.001），肉眼观察明显肿大。给药4周后，FLF 各组及Met 组的肝脏、肾脏指数均极显著低于M 组（P＜0.01 或P＜0.001），说明FLF 可明显抑制糖尿病小鼠的肝脏和肾脏肿大。由图1还可知，在本试验剂量范围内，FLF 剂量越大，抑制肝肾肿大的效果越好。

2.3 FLF 对DM 小鼠肝脏和肾脏T-SOD、GSHPX 水平的影响

超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性反应机体的抗氧化水平，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。由图2 可见，与N 组相比，M 组小鼠肝、肾组织中的T-SOD 和GSH-PX 含量极显著下降（P＜0.001），说明DM 发生过程中小鼠肝脏和肾脏的抗氧化能力受损，器官处于氧化胁迫之下。给药4 周后，与M 组相比，FLF 各剂量组及Met 组小鼠肝肾组织中的T-SOD 和GSH-PX 含量均显著提高（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001），且呈剂量效应，FLF高剂量组的改善效果甚至优于药物组，在数值上已经接近正常组水平。

图1 苦荞叶黄酮对糖尿病小鼠肝脏指数（左）和肾脏指数（右）的影响Fig.1 Effects of flavonoids extracted from F.tataricum leaves on the liver（left）and the kidney（right）index of diabetes mellitus mice

图2 苦荞叶黄酮对糖尿病小鼠肝脏和肾脏组织T-SOD、GSH-PX 含量的影响Fig.2 Effect of flavonoids from F.tataricum leaves on liver and kidney T-SOD，GSH-PX levels of diabetes mice

2.4 FLF 对DM 小鼠肝脏肾脏MDA 水平的影响

丙二醛（MDA）是最常见的脂质过氧化产物，其含量反映机体的脂质过氧化程度和受自由基攻击的严重程度，从而间接反应组织的受损程度。由图3 可见，M 组小鼠肝肾组织中的MDA 含量极显著高于N 组（P＜0.001）。给药4 周后，除FLFL 组肝脏的MDA 含量外，其余处理组的MDA 含量均显著低于M 组（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001），并且MDA 的含量随着FLF 剂量的增大而减小，且FLF-H 组与Met 组差异不显著（P＞0.05）。

图3 苦荞叶黄酮对糖尿病小鼠肝脏和肾脏MDA 含量影响Fig.3 Effect of flavonoids from F.Tataricum leaves on MDA levels in liver and kidney of diabetes mice

2.5 苦荞叶黄酮对糖尿病小鼠肝脏组织形态的影响

对各组小鼠肝脏组织进行HE 染色，观察病理变化，N 组小鼠肝小叶结构规整，肝细胞呈多边形，分布整齐，大小均一，肝细胞索以中央静脉为中心向四周放射排列（图4）。M 组小鼠的肝组织结构紊乱，肝细胞肿胀，肝索结构不清晰，胞质内出现大小不等不被染色的异常颗粒（图4B 处），肝窦不清晰、有出血（图4A 处）现象，肝脏组织严重受损。Met 组及FLF 高剂量组小鼠的肝组织结构明显改善，肝索结构较为清晰（图4E 处），肝细胞排列较为整齐，胞内异常颗粒减少，细胞炎症、坏死、出血现象显著改善。

图4 各组小鼠经HE 染色的肝脏组织切片图（400×）Fig.4 HE stained liver sections of mice from different groups（400×）

2.6 苦荞叶黄酮对Ⅱ-型糖尿病小鼠肾脏组织形态的影响

N 组小鼠肾组织结构规则，细胞排列整齐，肾小管上皮细胞未见异常，无炎性细胞浸润；M 组小鼠的肾小管结构紊乱，肾小管上皮细胞出现颗粒变性（图5B 处）、空泡变性（图5D 处），体积肿大，有少量的肾小管上皮细胞核固缩，坏死，肾间质中可见多量淋巴细胞浸润（图4C 处），结缔组织增生，肾组织纤维化。与M 组相比，Met 组及FLF 各剂量组小鼠肾组织结构明显改善，肾小管上皮细胞可见轻微的颗粒变形、肿大，未见明显坏死、炎性细胞浸润、出血。

图5 各组小鼠经HE 染色的肾脏组织切片图Fig.5 HE stained kidney sections of mice from different groups

3 讨论

来自荞麦不同部位的黄酮提取物均具有降糖降脂效果［5～12］。氧化应激在糖尿病发生过程中具有重要作用，研究者证实了银杏叶［13］、沙棘果［14］、杭白菊［15］、紫苏［16］、桑叶［17］等其它植物来源黄酮提取物对DM 模型小鼠或大鼠抗氧化功能的改善作用。刘小娜等研究者指出荞麦黄酮在降糖过程中对糖尿病动物模型的肾脏保护作用与其具有降糖、降脂、降 低 非 酶 糖 基 化 及 氧 化 应 激 水 平 相 关［18～20］。FLF 已经被证实对DM 小鼠具有降糖降脂作用［4］，本研究证实了其对DM 小鼠肝脏和肾脏病理损伤的修复效果，并揭示了其增强肝、肾组织抗氧化能力的机制。

本研究结果表明，DM 小鼠肝肾组织中的TSOD、GSH-PX 含量显著下降，MDA 含量显著升高，意味着这些器官的抗氧化能力显著下降，自由基的产生与清除失衡，自由基不断累积使这些脏器遭受高水平的氧化应激［21，22］，引起组织受损和过度的细胞凋亡，因而病理切片可观察到肝和肾发生了明显的水肿、炎症、出血、坏死等病变，所以肾病是糖尿病最常见的并发症之一，糖尿病肾病严重可导致肾功能衰竭。而肝脏是糖类、蛋白质和脂肪代谢的重要场所，又是机体很重要的内分泌器官之一［23］，肝组织的上述病变导致代谢受阻，进一步加剧了糖尿病小鼠的糖、脂代谢紊乱。大量研究表明，糖尿病患者几乎都存在着自由基代谢紊乱的现象［24］，机体内自由基水平直接影响糖尿病患者病情的发展［23，25］，因此糖尿病必须得及早进行控制。本试验结果表明，FLF 可显著提高糖尿病小鼠肝、肾、脾中T-SOD、GSH-PX 含量，显著降低MDA 含量，说明FLF 能有效地清除糖尿病小鼠体内的自由基，减少自由基造成的细胞损伤，使糖尿病小鼠的肝脏和肾脏指数显著下降，病理切片可观察到FLF 对受损肝肾组织明显的修复效果。

4 结论

糖尿病可引起小鼠的肝脏和肾脏病变，FLF 在降糖、降脂过程中，通过增加肝肾组织的抗氧化活性，减少氧化应激损伤，消除炎症和组织坏死来修复DM 小鼠受损肝脏和肾脏的组织结构，恢复其生理功能，且具有量效关系。