牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

师志海，王文佳，张 彬，孟红丽，王亚州，金 磊，兰亚莉*，徐照学,3*

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046；3.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002)

犊牛腹泻是临床上一种常见的综合征，影响犊牛健康，进而影响优质畜产品生产，给养牛业造成严重危害。其病因复杂，其中病毒感染是引起腹泻的重要原因[1]。据报道，除了牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)等常见的可以导致犊牛腹泻的病毒外，牛星状病毒(bovine astrovirus，BAstV)和牛诺如病毒(bovine norovirus，BNoV)等新发病毒在犊牛腹泻病原谱中也越来越备受关注[1]。

星状病毒(astroviruses，AstVs)是小型无囊膜的RNA病毒，直径28～30 nm，具有独特的5个或6个星状突起。因其宿主不同，AstVs又可分为两个属：哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus，MAstV)和禽星状病毒属(Avastrovirus)，分别感染哺乳动物和禽类[2]。婴幼儿感染人星状病毒是导致腹泻的主要原因之一。BAstV是MAstV属的一员，于1978年首次在英国暴发急性肠炎的犊牛中被发现。起初，BAstV被认为不能直接引起犊牛腹泻，但证实其可侵染牛回肠细胞，与BCoV等病毒联合感染时，BAstV对犊牛腹泻的致病力大大增加。2013年发现BAstV的某一谱系与牛的神经疾病和脑炎有关[3]，随后欧洲、北美、南美[4]等地也相继报道了类似病例，使得人们对BAstV及其分子流行病学和致病性备加关注。此外，BAstV还可能与牛呼吸系统疾病有关[5]，在患有急性呼吸系统疾病的人和动物的呼吸系统样本中均可检到AstV[5-6]。鉴于BAstV在牛不同疾病中的诸多角色，应引起人们注意。

目前，对BAstV的检测手段主要有直接电镜观察、原位杂交检测病毒的RNA[7]、组织切片免疫组织化学检测病毒的蛋白[8]和常规或巢式RT-PCR技术检测病毒核酸[9]。由于BAstV尚无成熟的细胞分离培养体系，且原位杂交技术和组织切片技术过程费时费力，对技术设备和人员素质的要求较高。而传统的RT-PCR方法尽管较为敏感，但易受到试验环境、技术操作等条件污染。荧光定量PCR方法是国际公认检测病毒的黄金标准，因其快速、简便、安全、灵敏度高且可定量等优点，所以更适用于临床检测。然而，当前国内还没有专门针对BAstV的快速检测方法。鉴于此，本研究基于BAstV基因的保守区域，建立了检测BAstV的荧光定量PCR方法，以期为BAstV的诊断及分子流行病学调查提供有力手段。

1 材料与方法

1.1 病毒株及被检材料BAstV、BNoV、BCoV及BVDV阳性病料均由本实验室收集并鉴定保存。221份腹泻犊牛的粪便样本于2017年9月至2019年5月在河南部分地区的牛场采集，样本均采于4月龄以下的腹泻犊牛。

1.2 主要试剂及仪器MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit(9766)，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)，pMD18-T Vector Cloning Kit(6011)，E.coliJM109 Competent Cells(9052)，2×Premix Taq(R004A)，DL2000 DNA Marker(3427A)，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(9762)等为TaKaRa公司产品；质粒小提试剂盒Plasmid Mini Kit(D6943)为OMEGA公司产品；2×EvaGreen qPCR SuperMix(AQ142-21)为北京全式金生物技术有限公司产品。

荧光定量PCR仪(SLAN24P)上海宏石医疗科技公司；高速冷冻离心机(5424R)德国Eppendorf公司；常规PCR仪(TP600)日本TaKaRa公司；超微量分光光度计(NanoDrop2000)美国Thermo Forma公司；凝胶成像分析仪(WD-9413B)中国北京六一生物科技有限公司。

1.3 引物设计与合成根据GenBank 公布的BAstV 基因序列(登录号：KJ620980)，针对BAstV ORF1a基因的保守区域，应用Oligo 6.0软件设计1对特异性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 BAstV目的片段PCR扩增引物

1.4 核酸提取将粪便样品用PBS 按1∶10混悬，反复冻融3次后，漩涡振荡，4℃、8 000 r/ min离心5 min，收获上清，-80℃保存用于后续试验。病毒RNA的提取参照核酸提取试剂盒，-80℃保存病毒RNA。cDNA的反转录参照逆转录试剂盒，-20℃保存。

1.5 重组质粒标准品的制备以BAstV 毒株的cDNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增。反应体系为25 μL：包括2×Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用胶回收试剂盒回收纯化目的片段，克隆于pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a。将重组质粒转化至JM109感受态细胞中，后涂在含有氨苄青霉素钠的LB琼脂平板上，37℃培养，挑取单菌落扩大培养，提取重组质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果正确的重组质粒作为反应模板及质粒标准品，用超微量分光光度计测定重组质粒的浓度，计算拷贝数(拷贝数=质粒浓度×10-9×6.02×1023/(660×质粒总长度))。

1.6 实时荧光定量PCR熔解曲线以重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a为模板，按照qPCR试剂盒提供的反应体系进行扩增，即SuperMix(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。扩增条件：预变性94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。熔解曲线条件：95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 30 s，60℃ 15 s，验证引物的特异性。

1.7 实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.7.1实时荧光定量PCR反应体系及条件的优化 以重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a为模板，按照qPCR试剂盒提供的反应体系，将退火温度设置为57,58,59,60,61,62℃ 共6个温度梯度，对退火温度进行优化。确定退火温度后将引物浓度设置为100,200,300,400,500 nmol/L，模板用量设置为1,2,3,4,5 μL，分别对引物浓度和模板用量进行优化筛选。循环条件：预变性94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。

1.7.2标准曲线的建立 将重组质粒依次进行10倍倍比稀释，得到109～101拷贝/μL等9个稀释度的标准品模板，按照1.7.1优化的反应条件进行扩增，绘制标准曲线。

1.7.3敏感性试验 将重组质粒进行10倍倍比稀释后作为模板，同时用等量Nuclease-free Water作阴性对照，根据已建立的荧光定量PCR方法进行扩增，观察扩增曲线，确定质粒的最低拷贝数。同时对相同模板进行常规PCR扩增，并比较2种检测方法的敏感性。

1.7.4特异性试验 以1.1中待检病原的cDNA为模板，使用本研究建立的荧光定量PCR方法进行扩增，以重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a为阳性对照，设Nuclease-free Water为阴性对照，以验证所建方法的特异性。

1.7.5重复性试验 以1.36×106～1.36×103拷贝/μL 4个稀释度的重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a为模板，分别进行批内和批间试验。批内试验：同一次试验下模板设3个重复；批间试验：同一试验条件下3个不同时间段分别进行3次试验，每次试验模板设3个重复；计算模板Ct值的标准差(s)和变异系数(CV)，验证实时荧光定量PCR方法的可靠性和重复性。

1.8 临床样本检测使用本试验建立的EvaGreen 荧光定量PCR方法对221份腹泻粪便样本进行检测，以获得河南省腹泻犊牛中BAstV的感染情况。

2 结果

2.1 BAstV目的片段的扩增利用自行设计的引物从BAstV毒株的cDNA中扩增出约150 bp的片段(图1)，经测序片段大小为157 bp，与预期相符。经BLAST检索，与GenBank上的基因序列完全匹配，为BAstV ORF1a基因的特异性序列。

M.DL2000 DNA Marker；1.BAstV阳性样品；2.阴性对照

2.2 实时荧光定量PCR熔解曲线重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a经扩增后，扩增产物在Tm值为84℃处出现单一波峰(图2)，无引物二聚体和非特异性扩增峰。

1.pMD18T- BAstV-ORF1a；2.阴性对照

2.3 优化的荧光定量PCR反应体系与条件经反应体系与反应条件优化，最终确定BAstV EvaGreen实时荧光定量PCR反应体系： 2×qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，模板2 μL，ddH2O 补至20 μL。最终确定的反应条件：94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。

2.4 标准曲线的建立根据拷贝数计算公式计算出重组质粒为1.36×1010拷贝/μL，用ddH2O将重组质粒依次进行10倍倍比稀释，选取1.36×109～1.36×101拷贝/μL的重组质粒作为标准品模板，依照优化后的反应体系及条件，进行EvaGreen实时荧光定量PCR扩增。结果显示，重组质粒为1.36×101～1.36×108拷贝/μL线性关系良好(图3)，回归方程为y= -3.48x+36.807，相关系数R2=0.999，扩增效率是93.79%。

图3 荧光定量PCR方法的标准曲线

2.5 荧光定量PCR的敏感性分析对重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a进行10倍倍比稀释，用等量Nuclease-free Water作阴性对照，应用本研究建立的荧光定量PCR方法进行扩增。结果表明，荧光定量PCR所能检出的最低拷贝数为13.6拷贝/μL(图4)。而常规PCR最低检出BAstV的拷贝数为1.36×103拷贝/μL(图5)，该荧光定量PCR方法是普通PCR方法敏感性的100倍，敏感性较高。

1～9.1.36×108 ～1.36×100拷贝/μL；10.阴性对照

M.DL2000 DNA Marker;1～9.1.36×108～1.36×100 拷贝/μL;10.阴性对照

2.6 荧光定量PCR的特异性分析用所建立的方法对BNoV、BCoV、BVDV的cDNA及重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a进行检测，结果显示该方法仅对BAstV 有扩增，其他病原及阴性对照均无特异性扩增(图6)。

1.重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a 1.36×105 拷贝/μL；2～5.BNoV、BCoV、BVDV、ddH2O

2.7 荧光定量PCR的重复性分析以4个稀释度的重组质粒pMD18T-BAstV-ORF1a为模板分别进行批内和批间重复性试验，结果显示批内Ct值变异系数(CV)为0.60%～0.91%，批间Ct值CV为0.60%～1.92%(表2)，均小于2.0%，表明该方法具有良好的可重复性。

2.8 临床样品的检测采用本试验建立的荧光定量PCR方法对221份犊牛腹泻粪便样本进行检测，BAstV的阳性检出率为18.1%(40/221)，采样场的阳性率为100.0%(14/14)。将该方法检出的全部阳性样品进行测序，证实均为BAstV的基因片段。

表2 荧光定量PCR的重复性

3 讨论

犊牛腹泻是临床上一种可引起犊牛死亡的常见综合征，给养牛业带来巨大的经济损失。由于其病因复杂，及时找出致病原因，并做出准确诊断，采取相应防治措施是成功控制犊牛腹泻的关键。犊牛腹泻病因包括病毒、细菌、真菌、寄生虫以及环境等生物学因子[10-11]，其中病毒感染是引起犊牛腹泻的重要原因，且病毒可通过急性、持续性或潜伏性等感染模式引起腹泻类疾病[12]。尽管腹泻犊牛粪便样品中检出BAstV已在世界多个地区报道，但BAstV感染或BAstV某一谱系感染与犊牛腹泻是否存在直接相关作用，犹未可知，但BAstV对牛小肠细胞的侵袭作用已经被证实[13]。遗憾的是，本试验并未对健康犊牛粪便样品是否存在BAstV进行检测，所以无法确定BAstV感染与犊牛腹泻之间存在的直接相关作用。因此，BAstV感染对犊牛腹泻的致病性，仍需进一步研究。

目前国内还没有专门针对BAstV的荧光定量PCR快速诊断方法。LÜTHI等[14]建立了检测新型BAstV毒株BoAstV-CH13/NeuroS1的荧光定量PCR方法，该检测方法使用特异性引物及其探针，对与脑炎有关的BAstV毒株能够进行准确检测。本试验试图使用上述引物及探针对腹泻样本中的BAstV进行检测，但未能成功；经比对，本研究中检出的BAstV毒株基因序列与上述探针及引物的序列同源性较低，且与BoAstV-CH13/NeuroS1毒株的基因序列同源性也较低；另外，使用荧光探针对病毒进行定量分析，该方法成本较高，不利于临床样本的大规模检测，所以仍需开发新的检测腹泻样本中BAstV的快速经济的诊断方法。此外，EvaGreen作为另一种用于实时定量PCR的DNA结合染料，相较于SYBR Green Ⅰ，EvaGreen更稳定更安全，且对PCR反应的抑制性更小，在定量PCR中EvaGreen的定量效果要优于SYBR Green Ⅰ[15]。本研究根据BAstV的ORF1a基因，成功建立了基于EvaGreen的BAstV Real-time PCR检测方法。该方法特异性强、重复性好，对临床样本中BAstV的最低检出限明显高于常规PCR检测方法，保障了BAstV检测结果的准确性和检出效率，为BAstV的防控和流行病学调查提供了有力的技术手段。

近年来，随着养牛行业的兴起和养殖数量的日益增加，犊牛腹泻和牛呼吸道疾病综合征等病症也突显出来，难以控制，成为困扰养牛业的难题，这可能与病原种类增加、新发病原感染率高、混合感染严重等因素有关。然而，BAstV的存在及流行情况在我国并不十分清楚，国内有关BAstV的报道非常缺乏，尤其河南省BAstV的流行情况尚无相关报道。ALFRED等[16]采用RT-PCR方法检测了我国广西省奶水牛牛群间BAstV的感染情况，结果显示直肠拭子样本中BAstV的检出率高达43.6%；田欣睿等[17]采用RT-PCR方法检测了我国川西北地区牦牛群感染BAstV的情况，BAstV在牦牛中的感染率为5.2%。本试验对2017年9月至2019年5月河南省14个牛场的221份犊牛腹泻样本进行检测，BAstV的阳性检出率为18.1%(40/221)，采样场阳性率100.0%(14/14)，表明该病毒已在河南省犊牛群中流行。这一结果对河南省犊牛腹泻的防控提供了重要参考依据。

本研究成功建立了基于EvaGreen染料的BAstV Real-time PCR检测方法，该方法灵敏性高、特异性强、重复性好，对BAstV的最低检出量为13.6 拷贝/μL，为BAstV的检测和分子流行病学调查提供了新的技术手段。BAstV作为国内一种牛的新发病毒，可能是一个重要的致犊牛腹泻病毒，应引起高度重视。