IFN-γ通过激活JAK/STAT信号通路上调手足口病患儿OAS1表达*

吴柳松， 何 英， 徐洪波， 陈 艳

（遵义医科大学附属医院小儿内二科，贵州遵义563000）

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一种由属于小RNA 病毒科的多种肠道病毒引起的儿童常见急性传染病［1］，好发于学龄前儿童。部分患儿可出现脑炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎以及循环衰竭等严重并发症，严重危害婴幼儿身体健康，甚至可能导致死亡。虽然手足口病的易感因素、发病机制及免疫特点等至今尚未完全明确，但宿主基因与病毒易感性的关系越来越受重视［2］。已经证实，宿主基因遗传背景在HFMD 的发生、发展过程中起着重要作用，宿主的遗传因素可通过调控某些细胞因子的表达或对细胞因子的反应性而调控宿主的免疫状态［3］。

干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）是一种由特异性抗原刺激T 淋巴细胞产生的多功能细胞因子，具有抗病毒、调节免疫系统等重要作用［4］。研究证实，IFN-γ 的异常表达与HFMD 的发生发展密切相关，是HFMD 病情严重程度及病情进展过程中的重要细胞因子，在HFMD 发病早期就出现表达升高，并可提示疾病重症发展的趋势［5］。2'，5'-寡聚腺苷酸合成酶1（2'，5'-oligoadenylate synthetase 1，OAS1）是一种由干扰素诱导的抗病毒蛋白，具有激活潜在性RNA 酶活性、降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成和促进病毒感染细胞发生凋亡的作用［6］。OAS1也是细胞信号通路中对细胞和环境胁迫产生响应的重要激酶，参与机体非特异性免疫和特异性免疫，在机体的抗病毒、信号转导等过程中起重要作用［3，7］。有研究报道，OAS1 作为干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）成员之一，其SNP 类型以及表达异常与HFMD 的易感性和临床表型相关［8］。然而，在HFMD中，IFN-γ 是否可以介导OAS1 基因的表达上调，依赖何种途径？目前尚不清楚。本研究主要探讨IFNγ 介导OAS1 基因表达升高的分子机制，并从遗传学角度为儿童HFMD 病情进展的早期诊治及发病机制提供理论依据。

材料和方法

1 研究对象

本研究选取于2015 年10 月～2019 年12 月在遵义医科大学附属医院儿科住院治疗的140 例HFMD患者，其中男童95 例，女童45 例，中位年龄2 岁5 个月，诊断均符合我国卫建委制定的《手足口病诊疗指南（2018 版）》标准。另外以同期在我院体检的健康儿童60 例作为健康对照组，其中男童34 例，女童26例，中位年龄2 岁1 个月；所有病例组及对照组儿童入组实验均经过家属同意，并签署知情同意书，所有检测对象均于住院或就诊当日清晨空腹采集外周静脉血5 mL，上述研究得到遵义医科大学附属医院伦理委员会批准同意。

2 病例分组

根据不同临床表现以及病情轻重，分为普通或轻症手足口病（mild HFMD，mHFMD）以及重症手足口病（severe HFMD，sHFMD），其中mHFMD 组82例，sHFMD 组58 例。mHFMD 为急性起病，伴或不伴发热，口腔粘膜出现散在疱疹，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等症状。sHFMD 表现为中枢神经系统或者心肺功能损伤，在发病1～5 d 左右出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，体征可见脑膜刺激征，腱反射减弱或消失，MRI显示有脑部病变。

3 试剂与仪器

RPMI-1640 培养基和胎牛血清（Gibco）；IFN-γ和AG490（Sigma）；兔抗OAS1、Janus 激酶（Janus ki⁃nase，JAK）1、JAK2、信号转导和转录激活因子（sig⁃nal transducer and activator of transcription，STAT）1、p-JAK1、JAK2 和p-STAT1 单克隆抗体（Abcam）；兔抗β-actin 单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）购自北京中杉金桥生物技术公司；Trizol（Invitrogen）；PCR 引物（上海生工生物工程公司）；RT-qPCR 试剂盒（TaKaRa）。超微量分光光度计（Implen）；高速离心机和Centrifuge 5804R 高速冷冻离心机（Eppendorf）；ChemiDoc 型凝胶成像系统（Bio-Rad）；超净工作台（北京亚泰科隆科技公司）；赛默飞3111 型CO2培养箱和Varioskan Lux 全波长酶标仪（Thermo Scientific）。

4 方法

4.1 外周血单个核细胞（peripheral blood mononu⁃clear cells，PBMCs）的提取和培养 取HFMD 患儿肝素抗凝外周血2 mL，用等体积生理盐水稀释混匀后，缓慢沿试管壁加入到含有等总体积的Ficoll 液面之上；室温下2 000 r/min 离心30 min，可见试管内的液体清晰地分为4 层，单个核细胞为处于第1 层和第2层中间的白色细胞；用吸管将单个核细胞层吸出收集到另1 试管中，用生理盐水洗涤2 遍，室温下1 500 r/min 离心10 min，弃上清后即得到较高纯度的单个核细胞悬液。

4.2 细胞培养及实验分组 将PBMCs 加入到含10%胎牛血清的RPMI-l640 培养基中，置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养至对数生长期备用。使用前将常规培养的PBMCs细胞无血清同步化培养24 h后随机分成3 组：对照（control）组、IFN-γ 干预组（用5×105U/L IFN-γ 干预细胞）和IFN-γ+AG490 干预组（用200 mmol/L AG490预处理45 min后加入5×105U/L IFN-γ 干预细胞），分别于加IFN-γ 前（0 h）和加IFN-γ后2、4、8、12和24 h收集细胞。

4.3 RT-qPCR 检测OAS1 的mRNA 表达 取新鲜肝素抗凝外周血4 ml，室温下2000 r/min 离心10 min，弃上清。取250 μL 血细胞按1∶4 体积加入RNAiso Plus，冰上裂解10 min，按说明书要求分别加入氯仿、异丙醇、无水乙醇以及离心处理，待提出总RNA 后，用适量的DEPC 水稀释，在ND-1000分光光度计上检测RNA 的浓度和纯度。按Trizol 法提取PBMCs 总RNA，经紫外分光光度计定量。严格按RT-qPCR 试剂盒操作进行逆转录，逆转录反应条件：37℃15 min，85℃5 s，4℃hold。逆转录完成后的cDNA 加入到RT-qPCR 反应体系中。OAS1 的上游引物序列为5'-GTCAGTTGACTGGCGGCTAT-3'，下游引物序列为5'-CGCTGCTTCAGGAAGTCTCT-3'；GAPDH 的上游引物序列为5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，下游引物序列为5'-AGCGTCAAAGGTGGAG⁃GAGTG-3'。RT-qPCR 条件为：95℃3 min；95℃5 s，59.5℃30 s，共30 个循环。以GAPDH 作为内参照，目的基因OAS1的表达根据仪器检测的Ct值，通过公式2-ΔΔCt进行相对定量分析计算得到。

4.4 Western blot 检测OAS1、JAK1、JAK2、p-JAK1、JAK2、STAT1和p-STAT1的蛋白水平 如4.3所述将外周血离心、弃上清后，取500 μL 血细胞，按1∶2 体积加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，收集充分裂解的细胞及所有残液，4℃、12000 r/min 离心30 min，取上清，用BCA 法进行蛋白定量。收集不同时点的PBMCs，按说明书要求冰上提取细胞总蛋白和核蛋白，用BCA法进行蛋白定量。取蛋白40～80 μg，进行SDS-PAGE 分离和转膜操作，室温下用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，磷酸化抗体用5% BSA 溶液封闭2 h，按对应抗体推荐浓度加入I 抗4℃孵育过夜，经TBST洗膜后加入对应HPR 标记的IgG，孵育后洗膜，ECL化学发光检测目的条带，在凝胶成像系统上观察分析并拍照。用目的蛋白与内参照蛋白的灰度值之比计算相应蛋白表达量。

5 统计学处理

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。实验计量数据按均数±标准差（mean±SD）表示，资料经正态性及方差齐性检验后，进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 和Dunnett 法。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 OAS1在HFMD患儿外周血中的表达

分别用RT-qPCR 以及Western blot 检测HFMD患儿外周血OAS1 的表达，结果显示，与正常对照组比较，mHFMD 组和sHFMD 组OAS1 的mRNA 表达明显升高（P＜0.01），sHFMD 组OAS1 的mRNA 表达显著高于mHFMD 组（P＜0.01），即随着HFMD 病情加重，OAS1的mRNA 表达进一步升高；Western blot 的结果与RT-qPCR结果一致，见图1。

2 IFN-γ 能够上调HFMD 患儿PBMCs 中OAS1 的表达

在HFMD 患儿PBMCs中加入5×105U/L IFN-γ和200 mmol/L AG490 进行干预，分别于0、2、4、8、12 和24 h 不同时点收集细胞，Western blot 检测PBMCs 细胞中OAS1蛋白的表达。结果显示，与正常对照组相比，IFN-γ干预组PBMCs中各观察时点OAS1的蛋白水平随着刺激时间的延长逐渐升高，并呈时间依赖性（P＜0.05），而AG490+IFN-γ 组PBMCs 中OAS1 蛋白的表达较IFN-γ 组呈时间依赖性显著降低（P＜0.05），见图2。

3 IFN-γ 能 够 促 进PBMCs 中JAK1、JAK2 和STAT1磷酸化

在HFMD 患儿PBMCs 中加入IFN-γ 以及AG490进行干预，分别于0、2、4、8、12 和24 h 不同时点收集细 胞，Western blot 检 测PBMCs 中JAK1、JAK2 和STAT1 蛋白及磷酸化的水平。结果发现，IFN-γ 刺激组的细胞在0、2、4、6、8、12 和24 h 各时点p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1的蛋白水平较正常对照组均显著升高（P＜0.05），并随着刺激时间的延长逐渐升高，呈时间依赖性；在各时点之间，JAK1、JAK2和STAT1蛋白水平的差异无统计学显著性（P˃0.05）；AG490+IFNγ 组 的p-JAK1、p-JAK2 和p-STAT1 蛋 白 水 平 较 较IFN-γ组均显著降低，并随着干预时间的延长呈时间依赖性降低（P˂0.05），见图3。

4 IFN-γ促进PBMCs中STAT1蛋白核转位

Figure 1. The expression of OAS1 at mRNA（A）and protein（B）levels in the peripheral blood of children with HFMD. Mean±SD. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs mHFMD group.图1 OAS1在HFMD患儿外周血中的表达

提取细胞的核蛋白，以histone H3 为内参照，采用Western blot 检测PBMCs 中STAT1 核蛋白水平，结果显示，IFN-γ 刺激组的细胞在0、2、4、6、8、12 和24 h 各时点STAT1 核蛋白水平较正常对照组均显著升高（P˂0.05），并随着刺激时间的延长逐渐升高，呈时间依赖性；AG490+IFN-γ 组STAT1 核蛋白的表达较IFN-γ组则呈时间依赖性显著降低，核转位显著减少（P˂0.05），见图4。

讨 论

Figure 2. The expression of OAS1 protein in the PBMCs of chil⁃dren with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.图2 HFMD患儿PBMCs细胞中OAS1蛋白的表达

HFMD 是一种由多种肠道病毒引起的儿童常见传染病，若不及早有效准确进行诊治和干预极易进展为重症，严重危害患儿身体健康。目前，HFMD 的发病机制尚未完全明确，越来越多的研究证实，机体免疫细胞功能紊乱和细胞因子的表达异常在HFMD的发生发展中起关键和核心作用［9］。INF-γ 作为一种多功能细胞因子，是抗病毒感染、抗肿瘤免疫反应等多个生理病理过程中的关键调控因子。本课题组前期研究发现，INF-γ 在HFMD 的发病过程中起重要作用，并可作为HFMD 病情严重程度的重要评估指标之一（文章待发）。通常，INF-γ诱导的自身免疫反应是通过介导下游诱导基因的功能来实现的。近年来，有研究显示INF-γ及其诱导的下游基因在病毒感染性疾病特别是HFMD 的发病中具有重要作用。已经证实，ISGs 在机体内可放大INF-γ 信号，激活适应性免疫反应，发挥抗病毒和免疫调节作用，但其具体机制尚不清楚。

近年来，JAK/STAT 信号通路的激活，在对抗病毒感染方面起到十分重要的作用［10］。研究已经证实，IFN-γ 可介导JAK/STAT 信号通路的激活，IFN-γ首先与靶细胞上受体结合，发生二聚体化后，再与细胞表面的受体结合，同时激活JAK-1 和JAK-2，JAK-1与受体α 亚基相互作用，JAK-2 与β 亚基相互作用，引起STAT1 的磷酸化，磷酸化的STAT1 形成二聚体INF-γ 激活因子（INF-gamma activated factor，GAF），进入核内与INF-γ 激活位点（INF-gamma activated site，GAS）反应元件结合［11］，从而启动下游相关基因的转录和表达［12］。

Figure 3. The protein and phosphorylation levels of JAK1，JAK2 and STAT1 in the PBMCs of children with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.图3 HFMD患儿PBMCs细胞中JAK1、JAK2和STAT1的蛋白和磷酸化水平

Figure 4. The expression of STAT1 nucleoprotein in the PBMCs of children with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.图4 HFMD患儿PBMCs中STAT1核蛋白的表达

本研究发现，HFMD 患儿外周血OAS1 基因的表达明显高于正常对照组，并且随着HFMD 病情从mHFMD 到sHFMD 逐渐加重，OAS1 基因的表达进一步显著升高，这提示了OAS1 基因可能参与了HFMD的发生发展。OAS1属于OAS 家族，是病毒感染先天反应的免疫蛋白，OAS1 的C 末端可以激活潜在的RNase L，调节核糖核酸酶L的抗病毒活性，导致病毒RNA 的降解，抑制病毒复制［13-14］。本研究在体外培养的HFMD 患儿PBMCs 细胞中加入IFN-γ 进行干预，结 果 显 示，IFN-γ 能 够 显 著 上调HFMD 患 儿PBMCs 细胞中OAS1基因的表达，并随着刺激时间延长，其相对表达量也呈时间依赖性上升趋势，这表明IFN-γ能够通过刺激介导OAS1的表达，来放大INF-γ信号，激活机体适应性免疫反应，发挥抗病毒感染和病毒清除作用。

本研究还发现，在IFN-γ 刺激下，p-JAK1、p-JAK2 和p-STAT1 的蛋白水平呈时间依赖性升高，而JAK1、JAK2和STAT1 蛋白表达水平的差异未见统计学显著性；STAT1 核蛋白的表达也呈时间依赖性升高，有研究曾在人宫颈上皮细胞（End1/E6E7细胞）中证实，STAT1 可以诱导OAS1 的表达升高［15］，这提示IFN-γ 可能是通过激活JAK/STAT1 信号通路从而上调HFMD患儿OAS1表达的。

为了进一步证实JAK/STAT 信号途径是否参与了IFN-γ 诱导的OAS1基因表达升高，本研究预先采用JAK/STAT 特异性信号通路抑制剂AG490 处理细胞后，再加入IFN-γ 进行干预。结果显示，在IFN-γ+AG490 组p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1 和STAT1 核蛋白以及OAS1 的水平均较IFN-γ 单独刺激组呈时间依赖性显著降低。这说明PBMCs 细胞经AG490 处理后，IFN-γ 刺激不能引起细胞内JAK 磷酸化，STAT1蛋白的核转位也显著降低，IFN-γ 刺激OAS1 的表达也受到抑制，提示IFN-γ 可能是通过磷酸化JAK1、JAK2-STAT1 信号通路，并促进了STAT1 蛋白核转位，从而诱导OAS1表达的。

综上所述，本研究结果表明IFN-γ 可以上调HFMD 患儿OAS1基因的表达，其机制可能与激活JAK/STAT信号途径有关。