黄芪多糖通过激活脂联素信号通路减轻小鼠溃疡性结肠炎*

宋 艳， 何永恒， 杨 芳， 罗 敏， 刘 杨

（湖南中医药大学第二附属医院肛肠科，湖南长沙410005）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性肠道炎症疾病，主要的发病部位为直肠和结肠，严重时会蔓延到整个结肠［1］。典型的临床特征包括腹痛、腹泻、黏液脓血便以及体重减轻，常反复发作，并伴随一系列的并发症，长期发展可能会引发癌变［2-3］。近年来，我国UC 的患病率逐渐增加，患病人群越来越趋于年轻化。目前，UC的病因和发病机制尚不清楚，普遍认为由遗传易感性、生活习惯、免疫反应和肠道微生物失衡多种因素相互作用所致［4］。

黄芪多糖（Astragaluspolysaccharide，APS）为黄芪中重要的生物活性多糖，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、修复神经损伤和免疫调节等功效［5-6］。已有研究表明，黄芪多糖对溃疡性结肠炎大鼠黏膜组织具有修复作用［7］，但对于其作用机制的研究仍相对较少，本研究通过构建溃疡性结肠炎小鼠模型，观察黄芪多糖对溃疡性结肠炎的干预作用及机制，为黄芪多糖治疗溃疡性结肠炎提供参考资料。

材料和方法

1 实验动物

40 只健康SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，体质量18～22 g，6～8 周龄，购自湖南中医药大学基础医学院。所有小鼠均饲养于温度为（22±2）℃、湿度为45%、12 h 光照与黑暗交替的饲养箱内，期间自由进食与饮水。

2 主要试剂

黄芪多糖（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%）；葡聚糖硫酸钠盐（dextran sodium sulfate，DSS）购自MP Biomedicals；脂联素（adiponectin，APN）和血红蛋白（hemoglobin，Hb）检测试剂盒（上海钰博生物科技有限公司）；HE染色试剂（上海蓝季科技发展有限公司），免疫组化染色试剂（上海古朵生物科技有限公司）；Trizol 试剂盒和SYBR Green qPCR Mas⁃ter Mix 试剂盒（TaKaRa），M-MLV 逆转录试剂盒（上海生工生物有限公司）；RIPA 裂解缓冲液、BCA 蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；脂联素受体2（adipo⁃nectin receptor 2，AdipoR2）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptorα，PPAR-α）和AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）抗体（北京中杉金桥生物有限公司）；GAPDH 抗体和HRP 标记的山羊抗兔IgG（Abcam）。

3 方法

3.1 小鼠分组、建模及给药 将40 只雄性C57BL/6小鼠随机分为5 组：空白对照（blank control）组、模型（model）组、黄芪多糖低剂量（low-dose APS，low-APS）组、黄芪多糖中剂量（middle-dose APS，middle-APS）组和黄芪多糖高剂量（high-dose APS，high-APS）组，每组8 只。将所有小鼠适应性饲养一周后开始实验，空白对照组小鼠饮用蒸馏水，其余各组均自由饮用5% DSS 溶液10 d 诱导制成溃疡性结肠炎模型［8］，每隔1 d 更换新鲜的DSS 溶液。于造模30 min 后，黄芪多糖各个剂量组分别按照100、200、400 mg/kg 剂量灌胃［9］，空白对照组与模型组分别予以相应体积的蒸馏水灌胃，每日一次，连续给药10 d。实验期间，每天观察记录各组小鼠体重、粪便性状及便血情况，进行小鼠疾病活动指数（disease activity in⁃dex，DAI）评分，评分标准为：体质量下降百分比（无下降或＜1%为0 分，1%～5%为1 分，6%～10%为2分，11%～15%为3 分，＞15%为4 分）、粪便性质（正常为0 分，粪便松散为2 分，腹泻或水样便为4 分）和大便出血情况（无便血为0 分，轻度出血/隐血为2分，血便为4分）。

3.2 血清APN 和血液Hb 水平测定 末次给药后，各组小鼠禁食12 h，麻醉后腹主动脉取血，取适量于室温下静置20 min，并在4℃下以4 500×g 离心15 min，采用酶联免疫吸附法测定血清中APN水平和血液中Hb水平，操作均严格按照试剂盒说明书进行。

3.3 小鼠结肠长度测定 采血后处死小鼠，小鼠置于冰上解剖，将整个结肠自盲肠到肛门段取出，预冷的PBS 溶液冲洗结肠，无张力状态下拉展平铺，测量各组小鼠结肠长度，将一部分结肠组织使用体积分数为10%的中性甲醛固定，另一部分快速冷冻后保存于-80℃冰箱。

3.4 HE 染色 将固定的结肠组织浸于梯度乙醇进行脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，制成4 μm 的石蜡组织切片，苏木精染色5 min，伊红染色液染色3 min，无水乙醇脱水，二甲苯中透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察并采集图片。

3.5 免疫组化染色 将制备的小鼠结肠石蜡切片脱蜡至水，采用柠檬酸盐水浴煮沸进行抗原修复，3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶，10%羊血清室温封闭30 min，滴加TNF-α 抗体（1∶400），在4℃下孵育24 h，PBS冲洗后，滴加Ⅱ抗室温孵育30 min，PBS再次冲洗，滴加DAB 显色10 min，经苏木素复染、梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，中性树胶封片，在电子显微镜下观察并进行图像采集，棕色至棕褐色着色为阳性表达。

3.6 Western blot 将结肠组织剪碎并加入RIPA 裂解缓冲液进行裂解，提取组织总蛋白，BCA 法进行蛋白浓度测定，电泳。10% SDS-PAGE 分离蛋白，切胶并转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Ⅰ抗（AdipoR2、PPAR-α 和AMPK 抗体以1∶1 000稀释，内参照GAPDH 抗体以1∶5 000稀释），在4℃下孵育24 h。TBST 漂洗PVDF 膜，加入HRP 标记的Ⅱ抗常温孵育1 h，TBST 洗膜后，滴ECL 发光液进行曝光，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白条带灰度值。

3.7 RT-qPCR 根据Trizol 试剂盒抽提小鼠结肠组织总RNA，紫外分光光度仪检测RNA 的浓度及纯度，用M-MLV 逆转录酶进行反转录，以cDNA 为模板进行qRT-PCR 扩增目标基因片段来检测表达水平，具体操作参考SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒说明书，以β-actin 为内参照。扩增程序为：95℃5 min（1 个循环）；95℃30 s，55℃15 s，72℃30 s（40个循环）。引物由上海生工生物有限公司合成，序列如下：AdipoR2 的上游引物序列为5'-TGGGGATCT⁃TATATGTTCGT-3'，下游引物序列为5'-CATTG⁃CAAGGTATGTGGGTA-3'；PPAR-α 的上游引物序列为5'-CGAGCTTCAGGACAATGCTGGTG-3'，下 游 引物序列为5'-AGCAGGTTGGTCAGCCACT-3'；β-actin的上游引物序列为5'-CTTCGCCGCTCCAGCACGC⁃TAC-3'，下游引物序列为5'-GCCGATCCACACG⁃GAGTAC-3'。采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA 相对表达量。

4 统计学处理

使用SPSS 20.0 软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠DAI评分比较

造模后，空白对照组小鼠未出现体重下降、腹泻、血便的情况；模型组部分小鼠于第2 天出现大便隐血阳性，在第3 天开始出现腹泻、血便，体重下降逐渐明显，DAI评分显著高于空白对照组（P＜0.05）；黄芪多糖给药组小鼠体重下降、腹泻、便血情况较模型组程度减轻，DAI评分显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖性，见表1。

表1 各组小鼠DAI评分比较Table 1. Comparison of DAI scores of mice in each group（Mean±SD. n=8）

2 各组小鼠APN与Hb水平的比较

与空白对照组比较，模型组小鼠血清APN 与血液Hb水平均显著降低（P＜0.05）；经不同剂量黄芪多糖给药的小鼠，血清APN 与血液Hb水平均显著升高（P＜0.05），呈剂量依赖性，见表2。

表2 各组小鼠血清APN和血液Hb水平的比较Table 2. Comparison of serum APN and blood Hb levels in the mice of each group（Mean±SD. n=8）

3 各组小鼠结肠长度变化

与空白对照组相比，模型组小鼠结肠长度显著缩短（P＜0.05）；与模型组相比，黄芪多糖各给药组小鼠结肠长度显著变长（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见图1。

Figure 1. Measurement of colon length of mice in each group.Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs blank control group；#P＜0.05 vs model group.图1 各组小鼠结肠长度的测定

4 各组小鼠结肠组织病理变化

空白对照组小鼠结肠黏膜上皮组织完整，结构清晰，细胞排列整齐，无病变现象；模型组小鼠结肠组织黏膜受损，腺体结构不完整，且肌层明显增厚，出现大量炎症细胞浸润；而经过各剂量黄芪多糖干预的小鼠结肠组织黏膜损伤程度较模型组明显减轻，少见炎症细胞浸润，见图2。

5 各组小鼠结肠组织TNF-α表达检测

空白对照组小鼠结肠组织胞浆内棕黄色颗粒较少，TNF-α 阳性表达率为（4.68±0.37）%；模型组小鼠结肠组织胞浆内有大量棕黄色颗粒，TNF-α 阳性表达率为（46.71±3.37）%，较空白对照组显著升高（P＜0.05）；黄芪多糖组小鼠结肠组织胞浆内棕黄色颗粒均较模型组减少，低、中和高剂量组TNF-α 阳性表达率分别为（24.06±1.94）%、（15.36±1.05）%和（9.55±0.87）%，与模型组相比均显著下降（P＜0.05），见图3。

6 各组小鼠结肠组织AdipoR2 和PPAR-α mRNA表达的比较

与空白对照组相比，模型组小鼠结肠组织中AdipoR2 和PPAR-α 的mRNA 相对表达量均显著下降（P＜0.05）；经过各剂量黄芪多糖作用的小鼠，结肠组织中AdipoR2 和PPAR-α 的mRNA 相对表达量均较模型组显著升高（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见图4。

7 各组小鼠结肠组织AdipoR2、PPAR-α 和AMPK蛋白表达的比较

与空白对照组相比，模型组小鼠结肠组织中AdipoR2、PPAR-α 和AMPK 的蛋白相对表达量均显著下降（P＜0.05）；与模型组相比，经不同剂量黄芪多糖给药的小鼠结肠组织中AdipoR2、PPAR-α 及AMPK 的蛋白相对表达量均显著升高（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见图5。

Figure 2. HE staining was applied to detect pathological changes in mouse colon tissue. Blank contol group：the structure of mouse co⁃lon was complete and clear；model group：damaged mouse colonic mucosa；low-APS group：the damage of mouse colon tissue was slightly attenuated；middle-APS group：the damage of mouse colon tissue was significantly attenuated；high-APS group：the damage of mouse colon tissue was obviously attenuated，and the structure was relatively complete. Scale bar=20 μm.图2 HE染色检测小鼠结肠组织病理变化

Figure 3. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of TNF-α in mouse colon tissue. Blank control group：less brown-yellow particles in the cytoplasm；model group：a large number of brown-yellow particles in the cytoplasm；low-APS group：the brown-yellow particles in the cytoplasm were slightly reduced；middle-APS group：the brown-yellow particles in the cytoplasm were significantly reduced；high-APS group：very few brown particles in the cytoplasm. Scale bar=20 μm.图3 免疫组化染色检测小鼠结肠组织TNF-α的表达

Figure 4. RT-qPCR detection of AdipoR2 and PPAR-α mRNA expression levels in mouse colon tissue. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs blank control group；#P＜0.05 vs model group.图4 RT-qPCR检测小鼠结肠组织AdipoR2和PPAR-α的mRNA表达水平

讨 论

UC 作为一种慢性炎症疾病，在全世界范围内的发病率逐年上升，且相关并发症逐渐增多［4］。尽管目前治疗UC 的方法较多，如氨基水杨酸制剂、皮质类固醇、硫代嘌呤、免疫抑制剂或者结肠切除术等，但这些治疗方法多伴随着严重的副作用［10］。因此，探索UC 过程中炎症反应和发病机制，寻找新的治疗策略，研发疗效更好、副作用更少的药物或疗法十分必要。

黄芪多糖具有广泛的生物学活性，已有研究表明，黄芪多糖可通过细胞周期停滞和线粒体凋亡途径对胃癌MGC-803 细胞表现出诱导凋亡的作用［11］，还能够通过下调CD40 的表达表现出抗黑素瘤的潜能［12］。此外，黄芪多糖对小鼠UC 有显著的治疗效果，为进一步明确黄芪多糖在治疗UC 中的作用，本研究通过DSS 诱导来建立UC 小鼠模型，给予黄芪多糖干预后评估其效果。本研究结果显示，黄芪多糖可改善UC 中稀便、血便及体重下降等症状，并且可维持肠黏膜和肠上皮的完整性，减轻炎症反应程度。

UC 过程中组织炎症通路激活后的炎症因子释放在组织损伤中起到重要作用，UC 肠道促炎因子和抗炎因子失衡后，炎症反应的启动及免疫调节功能紊乱，导致了UC 的慢性化发病过程［13-14］。TNF-α 是具有促进炎症作用的细胞因子，研究表明，TNF-α 能够促进中性粒细胞活化并产生浸润作用，从而进一步加重UC 结肠组织的炎症反应［15］。本研究结果显示，TNF-α 在UC 小鼠的结肠组织中表达水平升高，经过黄芪多糖干预后的小鼠结肠组织中TNF-α 表达水平下降。说明黄芪多糖能够抑制UC 中的炎症反应，从而减轻小鼠结肠组织的损伤程度。

Figure 5. Western blot for detecting protein expression of AdipoR2，PPAR-α and AMPK in colon tissues of mice in each group.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs blank control group；#P＜0.05 vs model group.图5 Western blot检测小鼠结肠组织AdipoR2和PPAR-α和AMPK蛋白表达水平

APN 是具有抗炎作用的特异性脂肪细胞因子，在肥胖和糖尿病患者血浆中APN 水平均降低，可视为抗肥胖和抗糖尿病激素［16］。还有研究表明，APN是先天免疫系统的关键调节剂，其在炎症的进程中起主要作用［17］。通常情况下，APN 水平在细胞中受到严格控制，并受到几种转录因子的调控。炎症性肠病（包括UC）患者血清APN水平明显降低［18］，APN对于炎症性肠病患者肠黏膜慢性炎症有调节作用，但具体作用机制尚未进行深入的探讨。AdipoR包括AdipoR1、AdipoR2 及T-钙黏素，且受体在不同部位的表达程度存在差异，受到诸多因子的调控作用［19］。

PPAR-α 信号通路和AMPK 信号通路是APN 及其受体的信号转导中的两条重要通路。PPAR-α 是一种核受体，作为负责调节脂质代谢的转录因子，PPAR-α 直接参与过氧化物酶体和线粒体β 氧化途径、脂肪酸摄取和甘油三酸酯分解代谢［20］。AMPK作为主要的代谢蛋白，是细胞内主要的能量传感器，可调节代谢合成与分解过程，从而保持糖脂代谢的平衡，也是APN 信号通路的重要下游通路［21］。在本研究中，UC 小鼠血清中APN 水平下降，同时AdipoR2、PPAR-α 及AMPK 表达水平降低，经不同剂量黄芪多糖给药后APN 水平升高，AdipoR2、PPARα及AMPK表达水平增加，说明黄芪多糖可能是通过APN 信号通路调节AMPK 和PPAR-α 的活性来实现对UC小鼠保护作用的。

综上所述，黄芪多糖可提高UC小鼠血清APN和血液Hb 水平，抑制炎症反应，从而减轻UC 小鼠结肠组织受损，其机制可能与其调控APN 途径及与之相关的PPAR-α 信号通路和AMPK 信号通路有关。然而研究中涉及的详细机制和干预的有效靶点未证实，后续有待进行深入探讨。