组蛋白去乙酰化酶抑制剂在造血干细胞体外扩增中的作用

陈 苗，庄俊玲

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院血液科，北京 100730

造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)具有维持自我更新和多向分化为不同谱系血细胞的特性，不同发育阶段及不同谱系分化受到严格调控，其中表观遗传调控在造血干细胞和祖细胞的分裂、扩增和谱系限制中发挥重要作用[1- 2]。表观遗传通过高度协调的基因激活和沉默，促使HSCs分化为多系成熟血细胞。

HSCs是处于G0/G1的静止细胞，在体外培养环境下，经历有限次数细胞分裂，不可控制地进入分化过程，丧失自我更新能力。研究者采用了多种技术方法，尝试促进HSCs自我更新复制，抑制定向分化，以期获得大量干细胞应用于干细胞治疗，并更深入地理解造血干细胞更新和分化的机制[3- 5]。基于组蛋白乙酰化修饰对于基因转录调控的重要作用，研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)影响干细胞中的表观遗传密码[6- 7]，在体外培养中能促进HSCs扩增，抑制分化。本文探讨了HDACIs在造血干细胞体外扩增中的作用及可能的机制。

组蛋白乙酰化修饰的转录调控作用

HSCs定向分化过程中的转变主要取决于基因表达模式的改变，维持自我更新的基因沉默，促进细胞分化的基因激活。表观遗传修饰是调控基因表达的重要机制之一，主要包括DNA/RNA甲基化、组蛋白修饰、组蛋白变体、染色质重塑、非编码RNA等[8- 10]。在干细胞分化过程中，表观遗传标记由染色质修饰酶动态调节，并应答于胞外分化诱导信号[11]。维持干细胞数量和干性需要稳定抑制与干细胞分化有关的基因，增加多能基因的表达[12- 13]。

组蛋白翻译后修饰可以调控基因表达，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等多种共价修饰[7- 9]，其中特征最明显的就是赖氨酸乙酰化。组蛋白乙酰化和去乙酰化影响染色质的转录活性。组蛋白乙酰化调节组蛋白的整体电荷，影响其与带负电荷DNA的相互作用，开放染色质，通过染色质构象改变控制基因表达，一般和转录激活相关[14]。因此，组蛋白乙酰基转移酶介导的赖氨酸乙酰化促进基因转录，组蛋白去乙酰基酶催化赖氨酸去乙酰化导致染色质失活。HDACIs则维持组蛋白乙酰化，使染色质变构促进基因表达。

组蛋白去乙酰化酶和HDACIs

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)作为多蛋白复合物的亚基存在于细胞中，去除赖氨酸残基乙酰化，抑制基因转录。在哺乳动物中，有18种HDACs，根据序列同源性分为以下4类：Ⅰ类HDACs(HDAC1、2、3和8)，Ⅱ类HDACs(HDAC4、5、6、7、9和10)，Ⅳ类(HDAC 11)和Ⅲ类(sirtuin家族：SIRT1- 7)[15- 16]。其中 Ⅰ 类HDACs与酵母转录调节因子钾依赖性降低3(reduced potassium dependency，RPD3)关系最为密切[17]，Ⅱ 类HDACs分为两个亚组：Ⅱa类，有1个大的C-末端；Ⅱb类，有2个去乙酰酶结构域。Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类HDACs依赖锌离子(Zn2+)并共享1个类似的催化核心催化乙酰赖氨酸水解，而 Ⅲ 类HDACs酶活性依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)[18- 19]。Ⅰ类HDACs广泛存在，主要分布在细胞核内；而Ⅱ类HDACs具有组织特异性，可以在细胞核和细胞质之间穿梭。转录共抑制因子，如哺乳动物sin3因子(mammalian Sin3，mSIN3)、核受体共抑制因子(nuclear receptor co-repressor，NCoR)和维甲酸与甲状腺激素受体转录沉默子(silencing mediator of retinoid and thyroid hormone receptor，SMRT)将Ⅰ类和Ⅱ类HDACs招募到转录因子中并发生相互作用，抑制基因表达[15]。

HDACIs抑制HDACs的活性和功能，增加赖氨酸乙酰化，促进基因转录表达。根据化学结构，HDACIs可分为羟肟酸、羧酸、苯甲酰胺和环肽类[20]，各类代表化合物及其作用特点见表1。

表1 HDACIs的化学结构分类及特点

HDACIs可以抑制HSCs中HDACs的活性，增加组蛋白乙酰化水平，使调节关键细胞和分子功能的基因数量增加[21]。研究表明，丙戊酸钠(valproate acid，VPA)联合细胞因子培养明显增加脐带血(cord blood，CB)CD34+细胞组蛋白H3乙酰化水平，红系特异性基因(如Eklf、EpoR、Gata2、Pu.1)及干细胞基因(c-Kit)启动子的组蛋白H3K9/14和H3K27乙酰化增加数倍[1]。采用3种Ⅰ类和Ⅱ类HDACIs(包括SCR、C433、VPA)分别处理CB-CD34+细胞24 h，检测HDACs活性，结果发现Ⅰ类(HDAC1、 2、3)、Ⅱa类(HDAC4、5)和Ⅱb类(HDAC6)活性不同程度下降，不同HDACIs作用强度有差异，其中SCR和C433抑制活性最强；但VPA对CB-CD34+细胞的扩增率最高，HDACIs对CD34+细胞的扩增效率并不与对HDACs的抑制强度直接相关[2]。

HDACs的过度表达在一些疾病的发生发展中发挥重要作用，HDACIs已经被用于多种疾病的治疗，尤其是抗肿瘤治疗，如SAHA/Vorinostat和FK228/Romidepsin治疗皮肤T细胞淋巴瘤[22- 23]，PXD101/Belinostat治疗外周T细胞淋巴瘤[24]，LBH589/Panobinostat治疗多发性骨髓瘤[25]。还有一些HDACIs则被用来在体外培养中促进干细胞重编程。

体外HDACIs促进造血干细胞扩增、抑制分化

HSCs的分裂有3种模式：(1)不对称分裂：1个HSC细胞分裂为1个HSC和1个分化的造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)，既保持了HSC数量，同时使HPCs进行性增加；(2)对称分裂(包括2种模式)：1个HSC可以分裂产生2个HSC(对称更新，使HSCs池扩张)或2个分化的造血祖细胞(对称分化，产生分化细胞而HSC耗竭)[4- 5]。HSC在体内通过控制不对称和对称的细胞分裂比例，能够平衡自我更新和分化，但在体外培养中会失去这种平衡，导致HSCs分化。使用细胞因子组合[包括干细胞因子、Fms样酪氨酸激酶(FMS like tyrosine kinase，FLT- 3)配体、血小板生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素(interleukin，IL)- 3、IL- 6或促红细胞生成素等不同组合]组成体外培养系统来扩增HSCs，有利于细胞大量增殖、分化，但产生大量祖细胞，不具备干细胞的长期重建能力[26]。多种小分子化合物被用来在体外培养中处理HSCs，抑制分化、促进对称性自我更新分裂，如芳香烃受体(AhR)拮抗剂(stemregenin 1，SR1)、嘧啶吲哚衍生物UM171，以及HDACIs[26]。HDACIs可以上调将早期HPCs重编程为HSCs的基因表达，这些与HSCs扩增和功能维持有关的基因在HSCs培养过程中被沉默，组蛋白乙酰化能促进这些基因表达。

羧酸类HDACI丙戊酸(valproate acid，VPA)抑制Ⅰ类和Ⅱa类HDACs，能使CB-CD34+细胞表观重编程，促进CB-HSCs扩增。研究发现，含血清培养体系下VPA处理HSCs产生更多分化细胞，即大量祖细胞和短期重建细胞而非长期重建细胞[7]。Chaurasia等[2]将CB-CD34+细胞采用无血清培养基细胞因子组合预分化后，加入VPA培养，发现多能细胞(CD34+CD90+)显著扩增。将预分化CB-CD34+细胞加入VPA培养(不含细胞因子)和VPA与细胞因子组合共同培养7 d相比较，结果发现后者扩增效果和移植重建造血能力更强，VPA的重编程作用和细胞因子的促增殖作用具有协同效应。这些发现支持使用无血清培养基，并将细胞因子组合和表观修饰剂联合，来扩增HSC。VPA处理使CD34+细胞中乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)活性增加，CD90、CD117、CD49f和 CXCR4表达增强。以这种方式扩增的HSCs能够在1、2、3和4级免疫缺陷小鼠受体中植入，重建多系造血。Walasek等[27]研究表明，在体外培养条件下，单独VPA处理或与氯化锂联用均能够保持小鼠HSCs的功能，与干细胞维持相关基因的上调和分化相关基因的下调，有效抑制诱导分化的细胞因子作用。

羟肟酸基团类非选择性HDACIs曲古他汀A(tricostatin A，TSA)也能促进CD34+细胞扩增。Milhem等[28]将成人骨髓CD34+细胞用TSA和/或地西他滨处理后培养，发现TSA处理的细胞与仅用细胞因子培养的细胞相比，CD34+细胞增殖率为6倍，CD34+CD90+细胞增殖率为2.5倍。但在此研究中，单独TSA处理的细胞在免疫缺陷小鼠中不能多系植入，而地西他滨和TSA先后联合处理的细胞有多系植入能力。DNA甲基化也是分化期间发育调控者之一，表观遗传机制存在相互交联，DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT1、3a)和HDAC相互作用抑制基因转录[29]。Saraf等[30]报道地西他滨/TSA处理动员的外周血CD34+细胞，CD34+CD90+细胞扩增(3.6±0.5)倍，原始克隆形成单位-混合(CFU-mix)扩增(10.1±0.5)倍，长期卵石样区域形成细胞(cobble stone-area forming cells，CAFC)增加(2.2±0.5)倍，并具有体内造血重建能力。DNA甲基转移酶抑制剂和HDACI联合可能具有协同激活沉默基因的作用，提示不同途径表观修饰剂联合可能具有协同扩增HSCs作用。

Tatetsu等[31]系统评估了466种小分子药物对人动员的外周血CD34+CD90+HSPCs的扩增能力，结果发现表观遗传修饰剂，尤其是HDACIs，能优先维持和扩增这些细胞。特别是单剂量HDACI浓度为50 nmol/L的TSA处理CD34+PBSCs与对照组(DMSO和细胞因子)相比CD34+CD90+细胞扩增最大(11.7倍)，TSA处理的PBSC-CD34+细胞异种移植实验中植入率显著高于对照组。这个小分子筛选实验进一步证实了HDACIs在HSCs体外维持/扩增培养技术中的强大作用。

HDACIs体外扩增造血干细胞的机制

HDACIs体外扩增HSCs的主要机制为上调与HSCs自我更新和功能维持有关的多能基因及将早期HPCs重编程为HSCs的基因表达。VPA培养扩增使CD34+细胞中乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)活性增加，多能基因(包括SOX2、OCT4、NANOG和Z1C3)的上调，敲除这些多能基因可以消除这种扩增作用[2]。VPA处理能够使小鼠HSCs的与干细胞维持相关基因的上调和分化相关基因的下调，抑制诱导分化的细胞因子[27]。TSA处理人动员的外周血CD34+HSCs，与HSPC相关基因(如GATA2和SALL4)表达增加[31]。地西他滨/TSA处理动员的外周血CD34+细胞，HSCs自我更新相关基因(包括HOXB4、GATA2、EZH2)的转录水平增加，髓系分化相关的基因(PU.1)转录水平下降[30]。HDACIs通过调节基因转录发挥作用，并可能与DNA甲基转移酶抑制剂具有协同作用。

相同培养条件下，不同的HDACIs对HSC的命运决定有不同的影响。每个HDACI具有1个独特的表达模式，如VPA上调糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GCP)/STAT网络(红细胞生成需要)的转录，但scriptaid并不能使其上调[21]。采用不同HDACIs处理CB-CD34+细胞，包括TSA、SAHA、VPA、SCR、CAY10433(C433)、CAY10398(MD85)和CAY10603，扩增效率有显著差异；VPA可以重激活Oct4启动子，促进诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)产生，而TSA则无此作用[2]。暴露于不同的HDACIs会导致潜在调节因子在HSCs不同阶段的不同表观遗传改变。非特异性HDACIs广泛抑制所有HDACs，靶点多作用复杂。筛选特异性HDACIs抑制特定类型的HDAC，可能针对性更强。如HDAC5属于Ⅱa型HDACs，特异性HDAC5抑制剂(LMK235)增加细胞核中p65乙酰化水平，显著上调人CB-HSCs和HPCs表面CXCR4的转录表达，促使SDF- 1/CXCR4-介导的趋化作用增强，增加干细胞在骨髓微环境中的归巢，并增加SCID-重建细胞(SCID-repopulating cell，SRC)数和增强在NSG小鼠长期重建能力[32]。下调HDAC3对于体外HSCs扩增是必要的[33]。

不同来源的HSCs扩增能力有差异，在相同的培养条件下，骨髓、动员的外周血和脐带血来源的CD34+CD90+细胞分别扩增2.4、3.6和10.9倍[30]。这种差异可能与个体发育阶段相关，也可能是由于不同来源HSC中促进对称分裂和重编程基因表达的表观遗传修饰深度差异所致。

表观修饰剂不仅能在体外扩增HSCs数量，对其免疫功能也产生影响。地西他滨/TSA扩增后的脐血中树突状细胞(dendritic cell，DC)HLA-DR/CD86和HLA-DR/CD11c共表达及混合淋巴细胞培养的同刺激能力均显著下降。HSC分化为DC依赖于STAT3。地西他滨/TSA扩增细胞中STAT3和STAT3抑制剂(包括SHP1、 p21和GATA1)的转录均显著增加，但p-STAT3占总STAT3的比率明显下降，说明 STAT3失活。延长培养后发现，地西他滨/TSA扩增细胞STAT3和STAT3抑制剂(包括SHP1)的转录水平与对照相当，而且仍能产生DC，说明STAT3 失活只是暂时的。扩增细胞中STAT3依赖的DC 分化被可逆性抑制导致同刺激能力下降[34]。

HDACIs扩增造血干细胞的安全性

扩增造血干细胞的目的是为临床干细胞治疗提供足够数量的干细胞，必须明确体外小分子化学物质处理后的细胞能否安全应用于人体。采用重编程因子创造iPSCs目前并不适合用于产生大量可移植的HSCs，因为有恶性转化的倾向(如形成畸胎瘤)[35]。

Lam等[36]报道在体外细胞实验中，采用TSA和VPA扩增CB-HSCs，脐血细胞中白血病相关基因，包括CDKN1C、CEBPα、HOXA9、MN1和DLK1表达上调。但目前在小分子HDACIs处理HSCs诱导的动物实验中，均未观察到明显的恶性肿瘤，在移植扩增后细胞的1代或2代NSG小鼠也未发现畸胎瘤的形成，而且在胚胎干细胞注射后形成畸胎瘤的部位注射扩增后的脐血多能干细胞并没有导致畸胎瘤形成[2]。表观遗传修饰剂(包括HDACIs、DNMTI)处理的HSCs未在受体小鼠中产生畸胎瘤或血液恶性肿瘤，可能是由于短期暴露于低剂量CMAs，多能性基因仅短暂上调，在连续移植后的人细胞中已观察不到这种上调。这些小分子只是暂时激活HSCs自我更新所需的基因程序，建立一个有限但充分的表观遗传特征时期，允许更多HSCs在短暂的培养期间产生，但并未创造出不可逆改变的永生细胞系。培养结束后，去除表观遗传修饰剂，预期使HSCs扩增的基因程序沉默，因此使白血病转化风险最小化，但又不影响已产生的HSCs遗传和功能特性。但HDACIs扩增的干细胞应用于细胞治疗的安全性还有待更充分的数据支持。

展 望

表观遗传修饰在多种人体生理、病理过程中发挥不同作用，HDACIs已成功治疗多种HDAC高表达的肿瘤性疾病，可诱导恶性克隆细胞凋亡和分化[22- 25]；在体外细胞研究中，HDACIs可以诱导髓系定向分化，如MS- 275诱导人K562红白血病细胞系的红系分化[37]，VPA增加人CD34+造血祖细胞体外培养巨核细胞/红系祖细胞的数量，同时抑制了巨核细胞分化[38]；而在体外造血干细胞扩增中，HDACIs促进培养的正常CD34+细胞自我更新产生造血干祖细胞。组蛋白乙酰化修饰的复杂作用是进一步研究的难点。从高选择性HDACIs和特异性HDAC着手，可能有助于确定分化信号诱导染色质修饰酶活性转变的信号通路，从而解释HDACIs的不同作用[39]。

体外扩增造血干细胞，尤其是脐血造血干细胞，增加治疗用干细胞的数量及干细胞归巢、重建造血和重建免疫的能力，将大大促进干细胞治疗技术的进步。信号通路化学小分子或骨髓基质共培养体系体外扩增的脐血细胞已进入临床试验。表观遗传小分子扩增造血干细胞在扩增效率、维持长期造血方面仍需提升，可以通过大规模高通量筛选扩增作用强的HDACIs和选择不同通路表观修饰剂协同作用，预期将进一步提高扩增效果，提供更高质量的干细胞产品。