Klippel-Feil综合征的临床特征及遗传学分析

李子全，耿墨钊，赵 森，吴志宏，仉建国，3，吴 南，3，王以朋，3

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1骨科 2北京市骨骼畸形遗传学研究重点实验室 3脊柱畸形大数据研究与应用重点实验室，北京 100730

Klippel-Feil综合征(Klippel-Feil syndrome，KFS)是一组以颈椎形成及分节障碍导致2个或以上椎体和/或椎体附件融合为特征的先天性畸形，其发病率约为1/40 000～1/42 000[1- 3]。KFS的典型临床特征可表现为短颈畸形、后发际线低和颈椎活动受限三联征[4- 5]，在临床上既可作为单独畸形出现，也可合并其他系统畸形，包括脊髓、泌尿系统、心脏、胃肠道、眼、耳等[6- 8]。

颈椎的先天性融合畸形可导致颈椎活动节段减少，进而造成相邻节段的过度活动或不稳定，加速颈椎退行性改变，甚至可能导致脊髓损伤的发生。然而，因为KFS的罕见性及临床表现的异质性，既往针对该疾病的研究多为个案报道或文献回顾。本研究总结了25例KFS患者的临床资料，并基于多基因panel二代测序，对KFS可能的致病基因进行检测，以期为探索KFS的早期诊断和有效病因学治疗靶点提供参考。

对象和方法

对象2015年1月至2018年12月在北京协和医院就诊并通过颈椎正侧位X线片及颈椎CT+三维重建检查确诊的KFS患者25例，其中，男15例，女10例，平均年龄(12.9±7.3)岁(5～45岁)。本研究经北京协和医院伦理委员会审核通过，患者本人和/或患者家长签署知情同意书。

资料收集整理入组患者病历资料，包括病史、流行病学、家族史、临床症状、体格检查结果等。入组患者均无家族遗传史，否认母亲孕期有明确药物史、毒物接触史及高温暴露史，并除外产时明确产钳使用史、脊柱外伤史者；影像学评估包括颈椎正侧位及前屈后伸位X线片、全脊柱正侧位X线片、CT+三维重建及MRI检查。根据颈椎正侧位X线片和CT+三维重建结果，记录每位患者颈椎融合节段及椎体畸形，并根据Samartzis分型将患者分为KFS Ⅰ型(颈椎单一节段融合)、Ⅱ型(颈椎非连续、多节段融合)及Ⅲ型(颈椎连续、多节段融合)[9]。所有患者均通过肺功能检查、超声心动图、腹部及泌尿系统超声评估是否伴发其他系统畸形，并通过MRI检查结果筛查是否合并脊髓畸形。

样本采集及保存抽取每例患者外周血标本(乙二胺四乙酸抗凝)2～4 ml，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN，德国)从外周血中提取全基因组DNA。通过NanoDrop ND8000(Thermo，美国)对提取的DNA浓度和纯度进行测量。浓度≥50 ng/μl、A260/A280介于1.7～1.9、OD260/230介于1～3的DNA样本视为合格，并于-20 ℃或-80 ℃保存备用。

Panel设计为了建立多基因二代测序panel，最大程度覆盖与KFS表型相关的候选基因，通过Human Phenotype Ontology(HPO；https：//hpo.jax.org/)、NCBI Gene(https：//ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM；http：//omim.org/)等数据库检索，结合近年来国内外相关研究，从KFS的相关疾病或表型中筛选出与之关联的基因564种，其中包含已报道的5种KFS致病基因：GDF6(MIM：601147)、MEOX1(MIM：600147)、GDF3(MIM：606522)、MYO18B(MIM：607295)和RIPPLY2(MIM：609891)[10- 17]。随后，使用在线工具NimbleGen(Roche，瑞士)(https：//design.nimblegen.com/nimbledesign/app)设计并购买了用于靶标捕获的DNA探针，最终的DNA探针可覆盖目标外显子+/-30 bp区域的99.7%。

高通量测序文库构建及上机测序将1 μg基因组DNA打断，每个基因组DNA片段大小约为200～250 bp，通过PCR扩增基因组DNA的目标区域、添加接头到扩增片段、进行文库扩增。然后通过Bioanalyzer分析(Agilent，美国)检测文库完整性。采用美国Illumina公司的Hiseq 2500测序平台将文库上机测序，模式为PE100。

测序数据分析原始数据经过质控过滤等处理，首先去除测序数据中的接头和低质量的碱基以及读长数据，再应用BWA软件与人类基因组参考序列进行比对(UCSC hg19，http：//genome.ucsc.edu/)，GATK软件对单核苷酸变异(single-nucleotide variants，SNV)和内部重复/缺失突变进行分析，最后通过测序公司内部注释进行标注和解释。为了筛查疾病密切相关的致病基因突变，首先在公共数据库：千人基因组数据库(1000 Genome Project，URL：http：//www.1000genomes.org/)、ESP6500数据库(Exome variant server，URL：http：//evs.gs.washington.edu/EVS/)和ExAC数据库(Exome Aggregation Consortium，URL：http：//exac.broadinstitute.org)中对高频突变位点(等位基因频率≥1%)进行滤过，并利用Mutation Taster、SIFT、Polyphen2软件评估突变位点致病性，筛选出3个软件均为高致病性的突变基因。

统计学处理采用SPSS 22.0统计软件，所有数据均进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，计数资料以百分率(%)表示，多组间比较采用Fisher确切概率法，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

临床特征25例KFS患者中，C1- 2颈椎融合3例(12%)，C2- 3颈椎融合10例(40%)，C3- 4颈椎融合8例(32%)，C4- 5颈椎融合6例(24%)，C5- 6颈椎融合5例(20%)，C6- 7颈椎融合15例(60%)，C7-T1融合9例(36%)；3例(12%)患者表现为寰枕融合、颅底凹陷和先天性寰枢关节半脱位等上颈椎畸形；9例(36%)患者合并有椎管内畸形，包括脊髓空洞、脊髓纵裂和脊髓栓系等；4例(16%)患者合并泌尿系统畸形(先天性肾缺如、多囊肾等)；2例(8%)患者合并心脏畸形(肥厚性心肌病、二尖瓣脱垂)；2例(8%)患者合并耳部畸形；合并胃肠道及眼部畸形各1例。

25例KFS患者中，3例(12%)表现为临床三联征，12例(48%)表现为颈椎活动受限，8例(32%)表现为短颈畸形，4例(16%)表现为后发际线低。11例(44%)患者没有任何典型的临床三联征表现，其中3例以斜颈为主要临床特征就诊。根据KFS的Samartzis分型，11例患者为KFS Ⅰ型，表现为单节段的颈椎椎体融合；5例为KFS Ⅱ型，表现为多个非连续节段的颈椎椎体融合；9例为KFS Ⅲ型，表现为多个连续节段的颈椎椎体融合。KFS Ⅲ型患者出现短颈(P=0.031)和颈椎活动受限(P=0.026)的比例明显高于KFS Ⅱ型和KFS Ⅰ型，且3例表现为临床三联征的患者均为KFS Ⅲ型(表1)。

KFS的panel测序分析本研究对多基因panel二代测序的结果进行突变数量和质量控制，96.7%的靶区域具有高质量的检测灵敏度。每个样本在靶区域上的平均测序深度约为210X，覆盖度为99.1%，平均数据量大小约为0.7G。

表1 KFS分型与临床三联征的相关性分析

通过突变频率的筛选，并采用生物信息学软件对获得的突变位点进行致病性预测，结果共在8例患者中检测到11种基因突变，包括COL6A1、COL6A2、CDAN1、GLI3、FLNB、CHRNG、MYH3、POR、TNXB，突变类型均为错义突变(表2)。未检测到已知的5种与KFS密切相关的致病基因突变位点。

在3例患者的CDAN1基因中发现2种罕见的杂合错义突变c.2482A>C(p.Thr828Pro)和c.1401A>C(p.Glu467Asp)，其中c.2482A>C突变导致密码子苏氨酸(ACC)转变为密码子脯氨酸(CCC)，c.1401A>C突变导致密码子谷氨酸(GAA)转变为密码子天冬氨酸(GAC)，两者在ExAC数据库的等位基因频率分别为0.008 798和0.000 041，均为罕见突变，且功能预测软件SIFT、Polyphen- 2和MutationTaster均提示为致病性突变；3例患者的临床特点均表现为以下多个连续节段的颈椎融合：C6-T1、C4-T1和C6-T1。2例患者表现为COL6A基因的致病突变，其中1例在COL6A2基因第2外显子检测到c.188C>T(p.Thr63Met)杂合错义突变，该突变导致第63位氨基酸的密码子苏氨酸(ACG)被甲硫氨酸(ATG)取代，该例患者为6岁男性，影像学及辅助检查提示C6- 7椎体融合、脊髓纵裂、脊髓空洞症和左肾缺如；1例患者为13岁男性，表现为COL6A1基因的c.2926C>T(p.Arg976Cys)杂合错义突变，检索NCBI的dbSNP数据库显示该突变在千人基因组计划和ExAC数据库中无相关报道，该患者影像学及辅助检查提示C6- 7椎体融合、髓内占位和双耳发育异常。

讨 论

KFS也称颈椎分节不良，患者多在出生后即出现畸形，但往往因表现出颈背痛、外观畸形或神经压迫症状时才得以就诊[1]。虽然该疾病具有短颈畸形、后发际线低和颈部活动受限的典型临床三联征表现，但文献报道约50%的KFS患者未表现出这些典型临床特征，因此KFS的诊断主要根据影像学[4]。

Samartzis等[5]研究发现，35.5%的KFS患者未表现出三联征的任意一种典型表现，38.7%、16.1%、9.7%的患者表现出1种、2种和全部三联征的临床特征。本研究25例KFS患者中，仅3例(12%)表现出全部三联征的临床特征，且有11例患者(44%)没有任何三联征的表现，与以往文献报道基本一致。此外，我们通过KFS的Samartzis分型进行分组比较，结果显示KFS Ⅲ型更容易表现出短颈、颈椎活动受限及临床三联征的特征。因此我们认为，长节段颈椎融合的KFS患者在临床中更需要引起关注，密切随访。对于无症状患者，应建议其避免或减少颈椎的过度屈伸和接触性体育运动；在症状较轻时，采用适度康复训练、支具支撑和牵引可一定程度改善症状，延缓手术并预防脊髓神经损害；进行性症状性颈椎节段不稳定、合并有颅颈交界区畸形、出现神经系统损害等均可为手术指征，对于手术方式前后路选择或经口寰枢椎复位内固定术等，尚缺乏大样本研究随访[18- 20]。

表2 KFS的多基因panel测序结果分析

本研究发现KFS患者在合并脊柱侧凸、胸腰椎脊柱畸形的同时，常伴发泌尿系统、心脏、胃肠道等其他系统畸形，本组中共有10例(40%)KFS患者合并骨骼肌肉系统以外的畸形[1，21]。因此，对所有KFS患者我们建议在初诊时应常规进行全脊柱正侧位X线片及全脊柱MRI检查；此外，完善超声心动图、腹部超声、泌尿系统超声等检查有助于全面系统地评估KFS患者伴发畸形情况，尽早进行临床干预，改善患者生活质量。

流行病学资料显示，KFS病例主要以散发出现，也有家族聚集现象，其发病与遗传因素高度相关。近年来，已有研究者报道与先天性颈椎融合畸形发病相关的致病基因，以上证据充分说明了遗传因素，尤其是基因突变在KFS患病中是不可忽略的。有研究发现在1个KFS家系中每个患者均携带GDF6基因的杂合错义突变(pA249E)，在散发病例中则发现2例无亲缘关系患者均携带杂合pL289P突变[10，22- 23]。因此，GDF6突变导致的常染色体显性遗传KFS被定义为KFS Ⅰ型(OMIM：118100)。Mohamed等[12]对1个阿拉伯裔KFS家系进行连锁分析后发现，该家系中所有患者的MEOX1均存在纯合缺失(c94delG)，这个突变导致读码框的改变，进而造成蛋白翻译的提前终止。并在另一个KFS家系中对这一基因进行了验证[12]。因此，MEOX1突变导致的常染色体隐性遗传KFS被定义为KFS Ⅱ 型(OMIM：214300)。Ye等[14]对1个北美KFS家系的研究发现，2例患者均携带GDF3杂合突变 c796C->T，该突变使氨基酸编码改变为pR226C。因此，GDF3突变导致的常染色体显性遗传KFS被定义为KFS Ⅲ型(OMIM：613702)。Alazami等[15]对2个有近亲结婚现象的家系进行研究，通过全外显子测序发现2例患者均有22号染色体MYO18B基因的纯合无义突变c.6905C>A。MYO18B突变导致的常染色体隐性遗传KFS被定义为KFS Ⅳ型(OMIM：617295)。最新研究中，Karaca等[16]描述了近亲家庭中患者具有典型KFS临床表现及完全性内脏转位，并证实先证者中RIPPLY2基因存在纯合移码突变(c.299delT，p.L100fs)，因此提出RIPPLY2的纯合移码突变是新型常染色体隐性遗传KFS的原因。

虽然已有上述5个KFS致病基因的报道，但仅能解释极少的KFS病例。Chacon-Camacho等[24]对墨西哥KFS患者的GDF3、GDF6基因进行测序，但没有发现任何已知致病突变。本研究中全部患者均未检出KFS已知的致病基因突变，因此我们推断KFS在遗传学基础上除了上述已报道致病基因外，可能存在其他的遗传学病因。

通过二代测序技术，本研究采用定制化基因构成的panel对25例KFS患者进行测序，扩大了与KFS相关联的候选基因列表。其中，CDAN1基因编码蛋白codanin- 1，已有充分研究证实该基因突变与先天性红细胞生成异常性贫血Ⅰ型(congenital dyserythropoietic anemia type Ⅰ，CDA Ⅰ)相关[25]，而Goede等[26]通过CDA Ⅰ的病例合并骨骼发育异常，包括并趾畸形、足趾发育不全等，提出骨骼畸形可能与CDA Ⅰ相关联，并因此推断codanin- 1可能在骨骼发育中起重要作用。Ru等[27]报道首例中国家系的CDA Ⅰ 合并第4、5跖骨的并趾畸形，测序结果显示该家系患者均存在CDAN1基因的复合杂合突变，但目前该基因在脊柱发育过程中的作用尚未见报道。本研究在3例患者中均检测到该基因杂合错义的致病突变，且3例患者均表现为KFS Ⅲ型并否认贫血相关的病史，因此提示CDAN1的突变可能与连续多节段颈椎先天性融合存在显著关联，在一定程度上扩展了对该基因已知表型的认识。COL6A基因的突变曾报道于先天性肌营养不良疾病，进行加重的脊柱侧凸和呼吸功能恶化是该疾病的典型特征，而COL6A基因负责编码 Ⅵ 型胶原蛋白的多肽链，胶原蛋白是骨骼有机质的主要组成部分，已有研究证实胶原蛋白与脊柱融合之间存在相关性[28]。目前尚没有研究证实COL6A基因与KFS存在关联，但我们推断COL6A可能通过影响胶原蛋白结构，导致椎体融合畸形的发生，这一推测尚待进一步的验证与深入研究。同时，本研究测序结果发现，1例患者同时表现出POR c.1858T>G(p.Trp620Gly)、MYH3 c.5263A>G(p.Lys1755Glu)和TNXB c.5103C>A(p.Phe1701Leu)的罕见错义突变，因此推测POR、MYH3和TNXB的低频突变在同一患者共同发生可能是导致颈椎融合畸形产生的机制，这些突变基因作用的共同通路或基因调控网络将为KFS的寡基因致病模式提供依据。此外CHRNG c.440G>A(p.Arg147His)、FLNB c.6625G>A(p.Gly2209Ser)和GLI3 c.2844G>A(p.Met948Ile)经检索均为目前尚未报道过的突变位点，通过公共数据库筛选(突变频率远小于1%)，且基于生物信息学理论的预测结果，可以推断突变会对基因产物产生重要影响，因此丰富了KFS的致病基因谱。

本研究对KFS患者临床特征及panel测序结果进行分析，但因样本量有限，未能进行基因型-表型的关联性分析及进一步功能验证，是研究的不足之处。以后将进行更大样本量、基于全外显子测序的分析研究。

综上，本研究结果显示，长节段先天性颈椎融合患者更易表现出短颈、颈椎活动受限及临床三联征的特征，如未及时干预治疗，可能会严重影响患者生活质量。因此在临床中更应引起关注、密切随访。此外，本研究筛选出COL6A、CDAN1等与KFS相关的候选致病突变，扩展了KFS的已知突变谱，为进一步阐明疾病的发病机制提供参考。