左旋芳樟醇的小鼠体内抗氧化及抗皮肤衰老活性研究

陈 耕

(湖南省食品和工业产品生产许可审查中心，湖南 长沙 410000)

衰老伴随着各种生理机能的减退，表现为行动能力减弱，抵抗力下降，记忆能力和学习能力减弱，感官能力减弱，外观上最容易发生变化的就是皮肤。皮肤衰老表现为皮肤由光洁变为黯淡，出现老年斑，弹性降低，松弛，粗糙等[1-2]。

自由基致胶原蛋白异常氧化、交联/断裂、变性，使皮肤变得干燥、皱纹增多，是皮肤衰老理论中最为广泛接受的理论之一[1]。根据这一理论，自由基清除剂、抗氧化剂可有效抗皮肤衰老。许多植物精油具有清除自由基、抗胶原蛋白氧化的活性[3]；而且，天然植物精油主要是脂溶性小分子，与细胞膜相容性好，能够快速渗透皮肤深层[4]。此外，植物精油还具有天然环保、使用方便的优点。因此植物精油已被广泛应用于抗皮肤衰老的药物及护肤品中。例如：白茶精油、乳香精油是一些美肌精华的主要成分之一；芳樟油、薰衣草油、香柠檬油、玫瑰木油、天竺葵油等植物精油及红花、川芎、香附以及干姜复方中药精油延缓皮肤衰老的功效已被报道[5-7]。

芳樟醇是香精香料工业中最常用和用量最大的单体香料，普遍存在于芳樟油、薰衣草油、香柠檬油、玫瑰木油等芳香植物精油中。它是一种单萜，香气佳，是配制香精香料时最受欢迎的原材料之一[8]。芳樟醇毒性低、对皮肤刺激性小，促透效果强，可促进其他成分进入皮肤[4]。Umezu等[9]研究证明，芳樟醇是薰衣草精油抗焦虑作用的主要药理活性成分。Mitic-Culafic等[10]研究发现，芳樟醇能有效清除肝细胞HepG2和淋巴B细胞中的自由基。芳樟醇是红花、川芎、香附、干姜等抗小鼠皮肤衰老复方中药精油的重要功效成分[7]。李亚文[11]研究发现，茉莉、桂花、栀子花、芳樟醇均具有抗衰老活性，其中芳樟醇效果最佳。有学者[12]发现，芳樟醇的不同光学异构体的药理效应存在差异，左旋芳樟醇催眠镇静作用优于消旋体和右旋体芳樟醇。左旋芳樟醇可用于防治头痛[13]、腹痛、痛经[14]、肌肉酸痛以及舒缓疲劳等[15]。以左旋芳樟醇为主要成分薰衣草精油有较强的抗氧化[16]、催眠镇静[17]功效；但有关其在体内抗皮肤衰老作用的研究尚未见报道。

研究拟以D-半乳糖致衰老小鼠为模型，涂抹或注射左旋芳樟醇乳液，监测小鼠自主活动情况，观察小鼠背部皮肤皱纹分布，测定小鼠血清和皮肤匀浆的超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量及皮肤匀浆羟脯氨酸(Hyp)含量等表征机体氧化、老化情况的指标，探讨左旋芳樟醇的体内抗氧化、抗皮肤衰老活性，以期为左旋芳樟醇的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

左旋芳樟醇：>98%(色谱纯)，厦门牡丹香华实业有限公司；

聚乙二醇-200：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

维生素E(VE)：国药准字H35020242，国药控股星鲨制药(厦门)有限公司；

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；

雌性小鼠：健康瑞士种(ICR品系)，体重30～45 g，湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司；

自发活动视频分析系统：ZH-ZFT型，淮北正华生物仪器设备有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-1800型，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 精油制备 左旋芳樟醇以聚乙二醇-200为溶剂稀释成质量分数分别为2.5%，5.0%，7.5%，分别作为低、中、高剂量精油；以聚乙二醇-200为溶剂，将VE稀释至质量分数为10.0%。

1.2.2 动物分组、给药 参照文献[11]并修改：健康小鼠75只，随机分为5组，分别为对照组、左旋芳樟醇精油组(低、中、高剂量组)、VE组，每组15只。试验前用剃毛器剃去小鼠两肩胛之间皮肤上的毛3 cm×3 cm。每天注射1.5 mg/g的D-半乳糖，连续注射30 d；对照组每天涂抹聚乙二醇-200，左旋芳樟醇组、VE组每天分别涂抹相应的药物，涂抹量均为1 mL/d，连续涂抹30 d。

1.2.3 小鼠的自主活动情况 第30天，末次处理1 h后，采用自发活动视频分析系统测定各组小鼠的自主活动情况。测定前8 h禁食禁水，将小鼠移入分析装置中，适应3 min，然后记录小鼠5 min内的自主活动情况，通过休息次数、休息时间以及总路程来表征小鼠的自主活动情况。

1.2.4 血清及皮肤匀浆的制备 第30天，末次处理2 h后，摘眼球取血，脱臼处死，迅速取背部脱毛处皮肤，生理盐水冲洗后用滤纸吸去水分，-20 ℃保存，用于制作皮肤组织匀浆。

(1) 血清制备：眼球血700 r/min离心10 min，取上层血清备用。

(2) 皮肤匀浆制备：取皮肤组织0.5～1.0 g，冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液、皮下脂肪和结缔组织，滤纸拭干，称取0.5 g，加入9倍生理盐水，用眼科小剪刀尽快剪碎，用内切式组织匀浆机匀浆(冰浴)，并反复冻融3次(-20 ℃2 h，常温1 h)，使细胞破碎，700 r/min离心15 min，取上清液备用[13]。

1.2.5 SOD活力、MDA含量及Hyp含量测定 参照试剂盒说明书。

1.2.6 皮肤水分测定 切取1 cm2颈部涂抹精油区域皮肤，精密称其湿重，80 ℃烘干12 h，称其干重。

1.2.7 小鼠皮肤拍照 小鼠摘除眼球之前，采用数码相机ISO800微距拍摄小鼠背部已脱毛皮肤照片，对比分析皮肤纹理、皱纹深度、黄褐斑分布等。

1.2.8 统计分析 应用SPSS 17.0软件处理数据，组间差异分析采用t检验法。

2 结果与分析

2.1 对小鼠自主活动的影响

由表1可知，与对照组相比，精油涂抹组小鼠的休息次数、休息时间减少，总路程增加。其中精油中、高剂量组、VE组的休息次数与对照组相比差异显著(P<0.05)，精油中剂量组总路程与对照组相比差异显著(P<0.05)。表明左旋芳樟醇和VE均能提高衰老小鼠的活动能力，具有抗衰老活性。

表1 左旋芳樟醇精油对衰老模型小鼠自主活动的影响†

2.2 小鼠血清、皮肤SOD活力、MDA含量

由表2可知，与对照组相比，左旋芳樟醇组、VE组血清、皮肤SOD活力上升、MDA含量下降，且差异显著(P<0.05)，表明小鼠皮肤涂抹左旋芳樟醇、VE能提高血清、皮肤SOD活力，降低MDA含量，与黄玲玲等[7]的研究结果一致。VE具有清除皮肤中自由基，降低MDA含量，延缓皮肤衰老的活性，与韩光[18]的研究一致。

MDA是脂质氧化的标志性产物，广泛用于表征体内氧化状态；芳樟醇处理可显著降低衰老小鼠血清、皮肤中MDA含量，表明芳樟醇在体内具有抗氧化活性。精油可通过直接清除H2O2、羟自由基、超氧化物、超氧阴离子等一系列自由基，也可通过提高抗氧化酶的表达[19-20]，如SOD等发挥抗氧化活性。试验表明，芳樟醇可显著提高衰老小鼠血清、皮肤组织中SOD酶活性。

表2 左旋芳樟醇对衰老模型小鼠血清、皮肤SOD活力、MDA含量的影响†

2.3 小鼠皮肤水分含量及Hyp含量

羟脯氨酸(Hyp)是胶原蛋白中的一种主要且含量稳定的氨基酸，约占13%，可用Hyp含量或其7.46倍代表皮肤胶原含量。胶原含量随皮肤衰老而下降，因此可通过测定Hyp含量来表征皮肤衰老情况[21]。由表3可知，与对照组相比，精油组、VE组小鼠皮肤中Hyp含量均显著增加(P<0.05)。黄玲玲等[7]研究发现，精油可使衰老小鼠皮肤Hyp含量极显著升高(P<0.01)。皮肤老化过程中，Hyp合成减少与真皮乳头层的微血管发生萎缩，血流量减少有关[22]；芳樟醇精油改善皮肤的微循环[23]，可促进皮肤组织合成Hyp[24]，且Hyp合成减少还与真皮中羟化酶失活有关[25-26]，自由基及脂质过氧化产物MDA的攻击是羟化酶失活的重要原因。试验表明，左旋芳樟醇在体内抗氧化活性较强，可清除MDA，有利于保护羟化酶合成Hyp。

由表3可知，左旋芳樟醇可显著提高衰老小鼠皮肤的水分含量(P<0.05)。皮肤中亲水性蛋白质含量及蛋白质氧化状态是决定皮肤水分含量及保水性的重要因素。皮肤中Hyp亲水性很强，其合成量减少，皮肤水合能力下降；蛋白质在自由基及脂质氧化产物(如MDA)作用下，亲水基团(如半胱氨酸的巯基，赖氨酸、精氨酸的氨基等)转化成疏水性羰基或发生交联，皮肤水合能力下降[27]。芳樟醇精油在体内具有显著抗氧化活性及显著提高皮肤Hyp含量，因此其皮肤水分含量也显著提高。

2.4 左旋芳樟醇精油对小鼠皮肤表观的影响

由图1可知，对照组、精油低剂量组皮肤粗糙有鳞屑，皱纹粗乱；精油中、高剂量组及VE组小鼠皮肤更加光滑、饱满，未见明显皱纹，老化情况明显改善。真皮胶原的流失，角质层变薄，皮肤组织水分减少，细胞皱缩、组织萎缩等是皮肤皱纹产生的主要原因[28]；芳樟醇精油可显著提高皮肤水分和Hyp含量，因此能明显抑制皱纹的产生。

表3 左旋芳樟醇对衰老模型小鼠皮肤水分及Hyp含量的影响†

图1 左旋芳樟醇对衰老模型小鼠皮肤皱纹的影响

在大鼠模型紫外线UV-B(280～320 nm)急性损伤试验中，芳樟醇可显著缓解皮肤增生、水肿形成、脂质过氧化，显著抑制环氧酶-2(COX-2)、鸟氨酸脱羧酶活性；在UV-B长期损伤试验中，芳樟醇可显著抑制NF-κB、TNF-α、IL-6、VEGF、TGF-β1、Bcl-2等增生细胞因子表达，降低肿瘤发生率[24]。在小鼠模型中，芳樟醇可有效抑制酒精致急性胃溃疡[13]；在t-BOOH致微生物突变试验中，芳樟醇可通过清除自由基，有效保护DNA[10]；在肺细胞中，芳樟醇显著降低MDA含量，激活Nrf2 信号通路，显著增加抗氧化酶的表达，并下调TNF-α、IL-6等炎症因子的表达[20,29-30]；在神经细胞中具有抗氧化、抗炎活性，从而对神经细胞具有显著保护作用，缓解大鼠模型帕金森氏症[31]。

3 结论

试验表明，芳樟醇精油可显著提高衰老小鼠自主活动能力，显著提高小鼠皮肤中超氧化物歧化酶活力(P<0.05)，显著降低小鼠皮肤中丙二醛含量(P<0.05)，以及显著提高小鼠皮肤中的水分、羟脯氨酸含量(P<0.05)，使皮肤更加光滑、饱满。因此左旋芳樟醇在体内具有较强抗氧化及抗皮肤衰老活性，抑制脂质氧化，促进羟脯氨酸合成可能是左旋芳樟醇抗皮肤衰老的机制之一，但其抗皮肤老化详细机制尚需进一步研究。