巢蛋白阳性星形胶质细胞与癫痫持续状态后海马区胶质瘢痕形成的相关性研究

潘楠楠,方子妍,郑乃智,周列民

癫痫持续状态(SE)是指惊厥持续30 min以上或惊厥反复发作,发作间期意识不能恢复[1]。SE可对海马区神经细胞造成持久的损伤[2-3]，SE超过60 min可继发难治性癫痫，甚至造成认知功能损伤、记忆及情绪障碍等中枢神经系统高级功能损害，给患者及其家庭、社会带来严重的负担。因此了解SE后海马神经细胞损伤对该区域相关疾病的致病机制，可为寻求SE后神经细胞保护方法提供更多的理论基础。

大量研究发现，SE后 3～7 d海马区星形胶质细胞数目显著增加，胞体明显肥大[3-4]，而星形胶质细胞数目和形态的异常可造成神经元兴奋性增高[5]，进一步引起星形胶质细胞过度增生，致使海马硬化、胶质瘢痕形成[6]，对海马区神经再生造成严重的持续的损伤。

目前关于SE后胶质瘢痕形成的具体机制尚不明确，有研究发现，大脑缺血缺氧损伤7 d 后大鼠脑内海马区出现大量肥大星形胶质细胞样巢蛋白(nestin)免疫阳性细胞表达，且其表达在时间上、形态上与星形胶质细胞增殖具有相关性。既往研究发现，SE后7 d 大鼠海马区nestin表达显著增加[7]，但其表达增加与星形胶质细胞增殖是否有关目前鲜有研究。

在本实验中我们采用匹罗卡品诱导SE大鼠模型，利用盲法免疫荧光组化检测海马不同区胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体(GFAP)数目、nestin与GFAP表达的变化，观察SE 7 d后nestin表达变化与星形胶质细胞是否存在相关性，以探讨SE后海马胶质瘢痕形成的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

选取6～8周雄性SPF级SD大鼠20只(由广东省动物中心提供)，随机分为SE组(10只)和对照组(10只)。溴甲阿托品和匹罗卡品购于sigma 公司，兔抗大鼠GFAP多克隆抗体、小鼠抗大鼠nestin单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor® 488)、驴抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 647)均购自abcom公司。

1.2 方法

1.2.1 SE大鼠模型的制备

采用匹罗卡品诱导SE大鼠模型[8]，当大鼠出现Racine标准Ⅳ级及以上发作后开始计时，如果30 min后癫痫发作在Ⅳ级以下，需继续追加匹罗卡品(50 mg/kg)腹腔注射一次，如经上述操作痫性发作仍未达到Ⅳ级以上，则将其剔除。出现Ⅳ级以上发作持续60 min后予腹腔注射地西泮(10 mg/kg，5 mg/mL)终止发作。对照组大鼠给予同等量的生理盐水腹腔注射代替溴甲阿托品、匹罗卡品和地西泮。

1.2.2 组织切片制备

在模型制备成功7 d后将两组大鼠麻醉，4%多聚甲醛进行心脏灌注，结束后快速断头取脑，置于4%多聚甲醛后固定24 h，然后用10%、20%、30%的梯度蔗糖脱水，修剪脑组织后OCT胶包埋，然后再冰冻切片机冠状切片，片厚10 μm，将脑片烘干后-4 ℃保存。

1.2.3 盲法免疫荧光组织染色

上述冰冻切片由课题设计者独立编号，并在整个实验过程中对实验操作者保密。

实验操作者取出冰冻切片后以正常山羊血清封闭，兔抗大鼠GFAP抗体、小鼠抗大鼠nestin抗体混合稀释孵育，再以山羊抗小鼠IgG H&L 、驴抗兔IgG H&L二抗混合孵育，每步均以PBS洗片，水溶性防淬灭封片剂封片后立刻荧光显微镜观察拍摄海马区GFAP、nestin的表达情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠SE发作情况

SE组大鼠在给予匹罗卡品后(1.67±0.19)min左右出现流诞等外周胆碱能反应；在(6.85±0.72)min左右出现面肌痉挛；在(15.61±0.85)min左右出现Ⅳ级以上发作，并呈SE出现，有两只在发作时间未达到60 min时即死亡。对照组大鼠在整个实验过程中均未出现癫痫发作。

2.2 两组大鼠海马区GFAP免疫荧光阳性细胞形态及计数结果

观察两组大鼠在造模成功7 d后海马各区GFAP免疫荧光染色(红色)结果，选取相同部位拍照(图1见封二)：对照组大鼠海马各区GFAP免疫荧光染色阳性细胞染色均一，突起分布连续、长短不一。SE组大鼠海马各区GFAP免疫荧光染色阳性细胞胞体及突起肥大，部分呈点、片状染色，与胞体连接的突起呈断点状连接。计数两组大鼠海马各区GFAP免疫荧光染色阳性细胞染色示SE组大鼠海马各区GFAP免疫荧光染色阳性细胞较对照组大鼠显著增加。结果评见表1。

表1 SE组与对照组大鼠海马各区GFAP免疫荧光染色阳性细胞数比较(个)

2.3 两组大鼠海马区nestin免疫荧光染色及与GFAP共标结果

观察两组大鼠在造模成功7 d后海马不同分区nestin免疫荧光染色(绿色)结果，选取相同部位拍照(图2见封二)：对照组大鼠海马nestin免疫荧光染色阳性细胞只少量出现在齿状回颗粒层，胞体呈较小的椭圆形；而SE组大鼠海马nestin免疫荧光染色阳性细胞大量、广泛分布在海马各区，细胞形态与星形胶质细胞相似；与GFAP免疫荧光染色(红色)共标结果显示(图3见封二)：对照组大鼠nestin免疫荧光染色(绿色)阳性细胞与GFAP免疫荧光染色(红色)阳性细胞无共标重叠(黄色)；而SE组大鼠nestin免疫荧光染色阳性细胞与GFAP免疫荧光染色阳性细胞大量重叠(黄色)(白色箭头所示)。

3 讨论

SE是临床常见的医学危急症之一，有较高的死亡率和致残率[9-11]。SE启动了一系列病理生理损害机制，致使神经组织缺血缺氧，引起胶质增生、突触重建等[12-13]。既往研究证实神经胶质细胞的数目及功能改变在SE对中枢神经系统造成的损伤过程中发挥重要的作用[14]。本研究采用匹罗卡品诱导SE大鼠模型，利用盲法免疫荧光组化检测海马各区nestin表达与GFAP的相关性，探讨SE后海马区胶质增生、胶质瘢痕形成的机制。本研究结果表明，SE 7 d 后海马各区GFAP 免疫阳性细胞数目较对照组显著增加，且胞体及突起明显肥大，染色呈团块状；nestin免疫阳性细胞数目较对照组显著增加，广泛分布于海马各区，与增生肥大的GFAP 免疫阳性细胞大量共标重叠；而在对照组，仅在海马齿状回颗粒层存在少量nestin免疫阳性细胞，与GFAP 免疫阳性细胞无共标重叠。

星形胶质细胞是中枢神经系统内数目最多、分布最广的胶质细胞[15]。既往大量研究证实癫痫发作可引起海马区星形胶质细胞的胞体肥大、数目增加[16-18]。这与本研究结果是一致的。星形胶质细胞数目和形态的异常，会对海马区离子和神经递质动态平衡造成破坏，从而导致神经元兴奋性增高，进一步引起星形胶质细胞大量增生，造成海马硬化、胶质瘢痕形成，对海马区功能造成不良的影响[5]。

nestin是一种中间丝蛋白，特异性地表达于神经干细胞(NSC)，既往被用作NSC的标记蛋白[19]，具有维持正常神经系统网络结构的功能。nestin具有胚胎细胞特异性，出生后其表达会很快降低甚至消失[20]，其后仅少量表达于海马齿状回颗粒下区和侧脑室下区[21]。既往研究发现神经系统受到损伤时(癫痫发作、脑缺血缺氧、脑损伤)会出现nestin的重新大量表达[22-24]，且nestin表达的高峰出现在神经系统损伤后第7天[25]，但引起nestin重新表达的病理机制尚不清楚，有学者猜测其表达增加是NSC增殖及NSC迁移的结果。但Tsyba等[26]发现脑卒中后创伤相关区域nestin表达增加与肥大增生的星形胶质细胞过度表达具有密切联系。在本研究中我们发现，大鼠SE 7 d后出现nestin免疫阳性细胞较对照组显著增加，并广泛分布于海马各区，与肥大增生的星形胶质细胞存在大量共标重叠； 而对照组nestin免疫阳性细胞胞体较小，呈椭圆形，仅在海马齿状回颗粒层边缘少量表达，与星形胶质细胞无共标重叠。

笔者认为这种SE后海马区大量广泛表达的nestin免疫阳性细胞可能不仅是NSC增殖分化及海马区NSC迁徙的结果，而更多是与SE致脑损伤引起星形胶质细胞过度活化有关，具有胚胎细胞的特性，可能与癫痫发作后海马区神经元丢失、星形胶质细胞增殖及胶质瘢痕形成有一定的联系。但本研究中只采用盲法免疫荧光共标观察nestin免疫阳性细胞增殖与星形胶质细胞的关系，提出SE后nestin表达增加与星形胶质细胞增殖密切相关，没有对nestin免疫阳性细胞的星形胶质细胞功能进行相关研究，这是我们下一步的研究方向。

总之，SE后7 d小鼠海马各区出现nestin免疫阳性细胞的星形胶质细胞大量广泛表达，可能与SE后胶质瘢痕的形成和神经可塑性的改变有关。进一步了解nestin免疫阳性细胞的星形胶质细胞大量出现的机制，寻求可靠的干预手段对治疗SE有重要的意义。