番茄GSNOR互作蛋白的筛选与鉴定

郭兆来，乔圣泰，李昆志，徐慧妮

（昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

0 引言

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种重要的信号分子，它对种子萌发、下胚轴伸长、叶片扩展、侧根形成、细胞凋亡以及植物抗逆反应等都发挥着重要的作用［1-5］.研究发现，NO主要通过对靶蛋白进行S-亚硝基化（S-nitrosylation）等蛋白翻译后修饰发挥作用［6］.NO可以与体内主要的抗氧化物质谷胱甘肽（GSH）反应生成S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）.GSNO参与的主要反应是将NO基团转移到靶蛋白的巯基上，形成S-亚硝基硫醇（nitrosothiols，SNOs），这个过程也被称为S-亚硝基化［7］.S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（S-nitrosoglutathione reductase，GSNOR），以前也被叫做谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶，属于醇脱氢酶III（alcohol dehydrogenase，ADHIII）家族成员，是特异的GSNO降解酶.GSNOR以NADH为还原剂催化GSNO反应生成GSSG和NH3.GSNOR通过还原GSNO调节胞内的NO、小分子SNOs和蛋白质亚硫醇（protein-SNO）的水平，间接调控蛋白亚硝基化的水平，保护机体免受硝化胁迫的影响［8］.GSNOR存在于细菌、酵母、哺乳动物、植物等所有物种中，保守性高［7］.GSNOR参与植物的生长和发育［9］，以及对生物和非生物胁迫的应答等［10］.

硝酸盐（NO3-）积累造成的次生盐渍化是设施蔬菜生产的主要障碍因子［11-13］.番茄是一种含有丰富维生素和其他营养成分的蔬菜，深受广大消费者喜爱，在我国南北方普遍种植.作者前期的研究表明番茄的GSNOR在硝酸盐胁迫24 h后表达量下降，但其作用的下游蛋白仍不清楚.本研究通过酵母双杂交技术筛选到一些与GSNOR互作的蛋白，为进一步研究番茄GSNOR的分子机理奠定基础，同时为番茄应答逆境胁迫机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

番茄品种为实验室保存的黄果自交系.拟南芥的cDNA文库购买于Clontech公司.酵母菌株Y2HGold、Y187、大肠杆菌DH5ɑ均为本实验保存.酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7购自Clontech公司.各种酵母培养基购自北京酷莱博科技有限公司.

1.2 GSNOR cDNA的获得以及诱饵表达载体的构建

利用Trizol试剂提取番茄根系RNA，反转录合成cDNA.以cDNA为模板，利用引物GSNOR-F：CACCATGGCTACACAAGGTCAAGTC和GSNOR-R：TACAAACATATCCAGGACAACA扩增得到GSNOR基因的cDNA片段.回收扩增片段后连接到pMD-18T载体，提取质粒进行测序验证.利用Gateway技术将GSNOR重组到pGBKT7和pGADT7载体上，转化到大肠杆菌后提取质粒进行测序.

1.3 诱饵表达载体的自激活检测

将测序正确的诱饵表达载体pGBKT7-GSNOR转化到酵母菌株Y2HGold中，经过选择性平板（SD/-Trp）筛选，同时转化pGADT7和pGBKT7作为阴性对照.将转化液稀释后涂布于SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-Ade平板上，将上述平板置于28℃环境培养3d左右，检测其自激活活性.

1.4 酵母cDNA文库筛选互作蛋白

将含有重组质粒pGBKT7-GSNOR的Y2HGold菌株摇至OD260=0.8，然后和含有拟南芥cDNA文库质粒的酵母Y187菌株进行混合杂交，离心收集菌体，用0.5×YPDA液体培养基悬浮菌体并涂到TDO（SD/-Trp/-Leu/-Ade）平板上，28℃培养3d左右.然后将平板上的菌落转移到QDO（SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His）平板上，菌落的编号不变，28℃培养后挑选菌落进行PCR检测，将扩出单一条带的菌液送到擎科生物科技有限公司测序，对测序后的结果进行比对分析.

2 结果分析

2.1 p GBKT7-GSNOR诱饵载体的构建

以番茄根系cDNA为模板，利用GSNOR-F和GSNOR-R引物进行PCR扩增，如图1的电泳结果显示.PCR扩增条带特异且大小为1140 bp左右（图1A），与预期结果一致.用Gateway技术将GSNOR重组到pGBKT7载体上，转化大肠杆菌DH5ɑ，挑选单菌落进行PCR鉴定（图1B），将阳性克隆送生物公司测序，显示序列正确，表明成功获得了pGBKT7-GSNOR的重组载体.

图1 诱饵表达载体pGBKT7-GSNOR的构建Fig.1 Construction of recombinant bait vector pGBKT7-GSNOR

2.2 重组质粒pGBKT7-GSNOR的自激活检测

将共转重组质粒pGBKT7（BD）-GSNOR和pGADT7（AD）空载体的Y2HGold菌株涂布于选择性平板DDO（SD/-Trp/-Leu）和TDO（SD/-Trp/-Leu/-Ade）培养基上进行培养.结果显示，在TDO培养基上，实验组和阴性对照没有菌落长出，说明pGBKT7-GSNOR载体在酵母菌株Y2HGold中无自激活活性，因此可以用于后续文库筛选（见图2）.

图2 pGBKT7-GSNOR自激活检测Fig.2 Identification of pGBKT7-GSNOR for auto-activation

2.3 互作蛋白的筛选与分离

将pGBKT7-GSNOR载体与拟南芥cDNA文库共转化酵母菌株Y2HGold感受态细胞，然后涂布在DDO固体培养基进行筛选.接着，挑选阳性单克隆进一步接种至QDO固体培养基进行筛选（见图3）.

2.4 GSNOR cDNA文库的筛选结果

图3 候选蛋白在QDO固体培养基中的筛选Fig.3 Identification of possible interaction proteins in the QDO plate

对QDO固体培养基上的菌落进行PCR扩增，将单一条带的菌落送测序，共300个样品，其中280个测出序列，随后进行BLAST分析，结果有260个比对成功，占总数的92.9%.根据基因号进行分类，得到了105个基因序列，通过TAIR（www.arabidopsis.org/index.jsp）网站查找其蛋白序列.如表1所示，GSNOR与代谢相关蛋白（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、转录因子（TCP、MYB和NAC等）、信号分子（如促分裂原蛋白激酶MAPK）、转运蛋白（如苹果酸转运蛋白、镁转运蛋白）等互作.

表1 GSNOR可能的互作蛋白Tab.1 Interacting protein of tomato GSNOR

续表1

利用Blast2GO对候选的105个基因进行了GeneOntology（GO）注释，如图4所示.GSNOR互作蛋白分为4类生物进程，11类细胞组成和4类分子功能.生物进程包括阴离子运输、细胞氧化还原稳态、囊泡介导转运和对细胞分裂素的反应.细胞组成包括线粒体外膜、叶绿体、内质网膜、质外体、胞质溶胶、叶绿体包膜、孔复合体、细胞内、叶绿体基质、染色体着丝粒区.分子功能包括蛋白质结合、电压门控阴离子通道活性、孔蛋白活性、染色质结合.

2.5 互作蛋白的分离和回复验证

为了验证筛选结果的可靠性，随机挑选5个阳性克隆，提取其pGADT7重组质粒，然后将BD-GSNOR诱饵质粒与这些重组质粒共转化酵母感受态细胞，涂布在SD/-Trp/-Leu营养缺陷型平板上培养，观察酵母是否正常生长.将这些生长正常的单菌落摇菌并点至SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板上培养，如图5所示.这些菌落能够在营养缺陷型的平板上正常生长，结果说明GSNOR与这5个候选蛋白在酵母细胞存在相互作用.

图4 GSNOR候选互作蛋白的GO注释Fig.4 Gene Ontology annotation of GSNOR candidate interaction proteins

图5 酵母双杂交回复验证Fig.5 Confirmation of positive interaction by yeast two-hybrid

3 讨论

NO是一种重要的信号分子，其介导S-亚硝化修饰是最近的研究热点之一.GSNOR是调控植物体内S-亚硝化水平的重要酶，通过调控GSNO的含量间接影响NO的含量［14］.GSNOR介导的蛋白去亚硝基化参与调控植物的信号转导、转录调控、植物基本代谢、细胞结构等多种细胞内的生理活动［15］.酵母双杂交系统是一种建立于酵母体内的用于研究蛋白质之间相互作用的基因系统.为了进一步揭示番茄GSNOR应答胁迫的分子机制，运用筛选酵母双杂交文库的方法，获得了105个互作蛋白，这些蛋白覆盖多种调控网络，涉及细胞基本代谢、转录调控、信号转导等过程，证实了GSNOR功能多样性的作用机制.GSNOR在不同物种中高度保守，在本研究中用的是拟南芥的cDNA文库，接下来需要对筛选到的感兴趣的蛋白在番茄中做进一步验证.

在筛选的互作蛋白中发现血红蛋白（hemoglobin）和硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）可能与GSNOR存在蛋白互作.血红蛋白是含血红素蛋白，普遍存在于动物、植物、细菌、真菌、原生动物等生物体中.研究表明在非生物胁迫和其他细胞水平上，血红蛋白调控细胞内的NO水平［16-17］.硫氧还蛋白是一类低分子量、热稳定、酸性蛋白，广泛存于原核生物和真核生物中，由Trx，Trx还原酶和NADPH构成的Trx系统，是组织和细胞内主要的去亚硝基化系统.通过对各种底物的去亚硝基化作用，Trx/TrxR系统在NO/SNO介导的信号过程和缓解SNO相关的细胞胁迫方面发挥了重要的作用［18］.酵母双杂交实验操作简便，但是存在部分的假阳性，需要利用双分子荧光互补、染色质免疫共沉淀等手段进一步验证互作蛋白.我们会通过其他技术手段对血红蛋白和硫氧化蛋白是否与GSNOR互作进行下一步的验证，通过互作蛋白来研究GSNOR参与硝酸盐胁迫分子调控机制.

4 结论

本文以番茄GSNOR作为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术，通过筛选cDNA文库，测序获得105个GSNOR相互作用的蛋白，这些蛋白在细胞代谢、转录调控、信号转导和细胞结构等方面都可能发挥重要作用.该结果为进一步解析GSNOR的作用机制提供了重要的理论基础.