MALDI-TOF MS在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速筛查中的价值

郭坤山， 王山梅， 马 冰， 许俊红， 张江峰， 荆 楠， 闫文娟， 马 琼， 李 轶

（1.许昌市感染性疾病病原体研究重点实验室 河南科技大学附属许昌市中心医院检验科，河南 许昌461000；2.河南省人民医院检验科，河南 郑州 450000）

近年来，随着抗菌药物的广泛应用，出现了越来越多的耐药性细菌。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）就是其中很重要的一种。由于其传播途径广、传播速度快、致病性强，并且表现出多重耐药性，常引起感染的暴发及流行，已成为临床治疗的难点。传统细菌鉴定及药物敏感性试验耗时长，在进行流行病学调查和院感防控时，很难满足临床需求。本研究运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术对病原菌进行快速鉴定，同时运用质谱软件的聚类分析功能及算法统计方式对MRSA进行快速筛选，以满足临床诊疗的需求。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集许昌市中心医院金黄色葡萄球菌临床分离株59株，其中MRSA 30株（编号为1～30号），甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus，MSSA ）29株（编号为31～59号）；另收集40株MRSA和40株MSSA，作为验证菌株。

1.2 仪器和试剂

哥伦比亚血平板、三氟乙酸和乙腈（上海晶纯生化科技股份有限公司），96孔加样板、α-氰基-4-羟基肉桂酸（alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）、多肽标准品、MALDI-TOF MS仪（德国Bruker公司）。

1.3 MALDI-TOF MS鉴定

将收集的菌株转种于血平板，35 ℃ CO2培养箱孵育过夜，并用 MALDI-TOF MS仪进行鉴定。

鉴定步骤[1-2]：（1）灭活，挑取2～3个中等大小的菌落于1.5 mL离心管中，加入300 μL蒸馏水混匀，然后加入900 μL无水乙醇混匀，12 800×g离心2 min；（2）提取蛋白，离心后弃去上层乙醇，下层沉淀加入50 μL 70%甲酸混匀，然后加入50 μL乙腈混匀，12 800×g离心2 min；（3）加样，取1 μL上清，加入96 孔加样板，干燥后，加入1 μL基质液覆盖样本；（4）校准定标，每次试验前均对仪器进行校准定标，以大肠埃希菌DH50t作为标准品；（5）鉴定比对，MALDI-TOF MS仪线性正性模式用最大频率（20～200 Hz）采集相对分子质量为2 000～20 000的蛋白图谱，将取得的特征性图谱与MALDI Biotyper软件（德国Bruker 公司）中的数据库进行比对，并用匹配分值来给结果定级；分值为2.300～3.000可以准确鉴定到种，分值为2.000～2.299可以准确鉴定到属。

1.4 鉴定复核

采用Vitek-2 Compact自动化鉴定药敏仪（法国生物梅里埃公司）进行鉴定复核，质控菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）和粪肠球菌（ATCC 29212），由我国国家卫生健康委临床检验中心提供；根据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute ，CLSl）2018年文件要求，使用头孢西丁纸片复核实验菌株：将浓度为0.5麦氏浊度的菌悬液均匀涂于MH琼脂平皿，将平皿置于35 ℃恒温培养箱中培养16～18 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，直径≤21 mm的菌株为MRSA，质控菌株金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）抑菌圈直径为23～29 mm。经测量，1～30号菌株抑菌圈直径均≤21 mm，鉴定为MRSA；31～59号菌株抑菌圈直径均≥22 mm，鉴定为MSSA。

1.5 数据分析

采用MALDI Biotyper软件分析59株实验菌株的同源性，采用ClinProTools 3.0 软件（德国Bruker公司）对质谱峰图进行分析，具体步骤参照ClinProTools 3.0 Manual软件要求进行。

2 结果

2.1 细菌鉴定结果

MALDI-TOF MS鉴定结果显示，59株实验菌株均为金黄色葡萄球菌，质谱分值均＞2.300，可以鉴定到种水平，MALDI-TOF MS对金黄色葡萄球菌的鉴定准确率＞99.9%。

2.2 MALDI Biotyper软件聚类分析结果

通过聚类分析把59株实验菌株分成A和B两大簇，A簇中MSSA占68.2%、MRSA占31.8%，B簇中MSSA占37.9%、MRSA占62.1%，表明聚类分析不能完全区分MRSA和MSSA。见图1。

图1 59株菌株聚类分析图

2.3 分类模型的建立

ClinProTools 3.0软件统计分析结果显示质荷比为6 812、17 668、7 594和11 990 m/z的蛋白峰是区分MRSA和MSSA最主要的特征性峰。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线显示，以上4个峰对应的曲线下面积（area under curve，AUC）均为1；凝胶浏览图显示MSSA在4个峰的蛋白强度均高于MRSA。根据数据分析结果，选取6 812和17 668 m/z蛋白峰，运用ClinProTools 3.0软件建立分类模型。运用遗传算法进行峰统计之后，将MRSA和MSSA菌株较清晰地划分成2个区域，所有菌株均准确落在相应的MRSA或 MSSA的分组中。见图2。

图2 MSRA、MSSA分类模型图

2.4 模型验证

随机选取80株验证菌株中1株的质谱峰图放入模型中MRSA区域，ClinProTools 3.0软件峰统计结果显示其准确落在MRSA聚类中，见图3（a）。将此株验证菌株的质谱峰图放入模型中MSSA区域，ClinProTools 3.0软件峰统计结果显示MRSA在未被放入正确位置的情况下，会打破已建模型，从而无法准确区分MSSA和MRSA，见图3（b）。

图3 1株验证菌株的质谱峰图放入模型中的验证图

采用同样的方法对80株验证菌株一一进行验证，有2株MRSA被错误地分类到MSSA区域，7株MSSA被错误地分类到MRSA区域。统计结果显示其敏感性为95.0%、特异性为82.5%、阳性预测值为84.4%、阴性预测值为94.3%。

3 讨论

MALDI-TOF MS在金黄色葡萄球菌的鉴定中具有快速、准确、成本低等优势，但目前利用质谱图的差异来快速区分MRSA和MSSA的报道较少。本研究运用MALDI Biotyper软件的聚类分析功能来分析金黄色葡萄球菌的同源性，运用ClinProTools 3.0软件分析MRSA与MSSA质谱峰图的差异，选取具有统计学差异的蛋白峰来建立分类模型，从临床分离菌株中快速筛选出MRSA，与菌种鉴定相比具有同等优势，弥补了纸片扩散法和仪器法耗时长的不足。

有研究人员比较了76株金黄色葡萄球菌的质谱图，发现MRSA与MSSA的峰图之间有很大差异，将数据库中MRSA和MSSA的质谱图进行聚类分析，可分为MRSA和MSSA两大簇[3]，提示MALDI-TOF MS可作为一种简单且快速的方法用于细菌的药物敏感性分析。本研究结果显示，聚类分析对MRSA的鉴定准确性只有62.1%，不能鉴别同源性近的MRSA和MSSA。同源性菌株质谱峰图具有高度相似性，在进行同源性分析时，其MRSA特异峰的强度不足，造成部分同源性近的MRSA与MSSA不能被区分。本研究菌株来源同一实验室，可能存在同源性，结果与文献报道[4-6]一致。

本研究发现，ClinProTools 3.0软件同时分析大量菌株时，无法区分MRSA和MSSA，推测可能是每株菌特异峰的累积掩盖了MRSA和MSSA的差异峰导致的；选取部分MRSA和MSSA的峰图进行分析，发现可以区分2种菌。质荷比为6 812、17 668、7 594和11 990 m/z的4个蛋白峰有统计学差异，峰值均为MSSA高于MRSA，选取其中2个差异蛋白峰建立模型可以区分MRSA与MSSA，本研究选取6 812和17 668 m/z的蛋白峰建立模型，其敏感性为95.0%、特异性为82.5%、阳性预测值为84.4%、阴性预测值为94.3%。本研究发现的蛋白峰与胡燕燕等[7]发现的蛋白峰不同，可能与实验菌株来源不同有关，本研究菌株均来源于同一实验室，后续将收集多中心样本进行综合分析，进一步验证这一模型的使用范围。

总之，质谱峰图能快速、准确地区分MRSA与MSSA，可在临床实验室推广使用。