mCIM与eCIM在产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌表型筛查中的价值

尹 娟， 王莹超， 眭 阳， 江 春， 时蕴琦， 朱超望

（1.南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院消化系疾病与营养研究中心，江苏 苏州 215008；2. 南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院检验科，江苏 苏州 215008）

近年来，随着碳青霉烯类药物在临床的广泛应用，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）给临床抗感染治疗带来很大困扰。携带碳青霉烯酶基因是CRE的主要耐药机制，这些耐药基因存在于可转移质粒上，可以在不同菌株间水平传播 。为了及时、有效地治疗CRE感染，临床实验室必须具备快速、准确的鉴定能力。2009年，美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐改良Hodge试验（modified Hodge test，MHT）作为肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型筛查的常规方法；2017年，CLSI推荐改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）作为肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型筛查方法；2018年，CLSI推荐采用mCIM和乙二胺四乙酸碳青霉烯灭活试验（ethylene diamine tetraacetic acid-carbapenem inactivation method，eCIM）[1]进行肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型筛查。mCIM用于检测肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌中的碳青霉烯酶；eCIM与mCIM联合使用，用于区分产金属酶和丝氨酸碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。本研究拟比较MHT和mCIM、eCIM在筛查肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集2017—2018年南京医科大学附属苏州医院分离自临床样本的亚胺培南和美罗培南耐药肠杆菌科细菌117株（实验组），包括肺炎克雷伯菌83株、大肠埃希菌13 株、产气肠杆菌9株、阴沟肠杆菌5株、产酸克雷伯菌4株、科泽枸橼酸杆菌2株和弗劳地枸橼酸杆菌1株。另收集同期南京医科大学附属苏州医院碳青霉烯类敏感肠杆菌科细菌临床分离株50株为对照组。所有菌株均采用Phoenix 100全自动细菌鉴定仪及配套革兰阴性检测板进行细菌鉴定和体外药物敏感性试验，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）进行确认。质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）购自我国国家卫生健康委临床检验中心。

1.2 仪器与试剂

Phoenix 100全自动细菌鉴定仪（美国BD公司），Arktik PCR扩增仪（美国Thermo公司），ProXima凝胶成像仪（荷兰ISOGEN公司），Bruker Microflex LT/SH质谱仪（德国Bruker公司），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应试剂盒（日本Takara公司），美罗培南和亚胺培南药物敏感性试验纸片（英国Oxoid公司），血琼脂平板和MH平板（郑州安图生物有限公司）。

1.3 碳青霉烯酶基因检测

采用煮沸法制备DNA模板，PCR扩增引物及反应条件参照文献[2-3]，引物信息见表1。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳及测序确认。

表1 碳青霉烯酶基因引物信息

1.4 产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌表型筛查

1.4.1 MHT 用0.9%氯化钠溶液配制0.5麦氏浊度大肠埃希菌（ATCC 25922）菌液，1∶10稀释，用棉签涂布于MH平板，在MH平板中心贴亚胺培南纸片，挑取孵育过夜的测试菌株，从纸片边缘向外划直线，35 ℃孵育16～20 h后判读结果。观察靠近待测菌株处的大肠埃希菌生长有无增强，如有增强则判为阳性。

1.4.2 mCIM和eCIM 取2管2 mL TSB肉汤，1管为mCIM试验管，1管加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液用于eCIM试验（EDTA终浓度为5 mmol/L）。用1 μL接种环刮取满环血琼脂平板上过夜培养的受试菌菌株，分别加入上述2管TSB肉汤中，将美罗培南纸片浸入菌悬液，35 ℃温育4 h。制备0.5麦氏浊度大肠埃希菌（ATCC 25922）菌悬液，并均匀涂布MH平板，用10 μL接种环将美罗培南纸片取出贴至MH平板，同一受试菌mCIM和eCIM试验管中的美罗培南纸片贴于同一MH平板，35 ℃温育20 h，测量抑菌圈直径。结果判断：（1）mCIM试验，若美罗培南抑菌圈直径为6～15 mm或直径为16～18 mm，但抑菌圈内有散在菌落，则结果阳性，即产碳青霉烯酶；（2）eCIM试验，当mCIM结果为阳性时，若2张纸片抑菌圈直径之差≥5 mm，则判为阳性，即产金属酶。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。敏感性比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 碳青霉烯类耐药基因检测结果

117株CRE中，有108株检出碳青霉烯类耐药基因，其中91株携带blaKPC-2、8株携带blaNDM-1、6株携带blaNDM-5、2株携带blaIMP-4、1株同时携带blaKPC-2和blaIMP-4基因。50株碳青霉烯类敏感肠杆菌科细菌均未检出碳青霉烯耐药基因。见图1。

图1 部分碳青霉烯类耐药基因PCR产物电泳分析

2.2 MHT、mCIM、eCIM表型筛查

108株携带碳青霉烯酶基因的CRE中，MHT阳性94株，敏感性为87%；阴性14株，均携带blaNDM基因；mCIM均为阳性，敏感性为100%，显著高于MHT（χ2=14.97，P＜0.01）。14株携带blaNDM基因的菌株eCIM显示阳性，2株携带blaIMP基因的菌株在EDTA浓度为5、10、20 mmol/L时eCIM均显示为阴性；1株同时携带blaKPC和blaIMP基因的菌株，eCIM为阴性；eCIM敏感性为82.4%（14/17）。50株碳青霉烯类敏感肠杆菌科细菌MHT 、mCIM和eCIM均为阴性。见图2、表2。

图2 部分MHT、mCIM和eCIM结果

表2 MHT、mCIM、eCIM碳青霉烯酶表型筛查结果 株

3 讨论

CRE感染是一个全球性的健康问题，快速、准确地检测CRE对于预防和控制其传播至关重要。MHT操作简单、不需特殊试剂及仪器，目前已被临床微生物实验室广泛采用。MHT对大多数碳青霉烯酶，特别是KPC酶的敏感性是可以接受的，但对产金属β-内酰胺酶的敏感性较低[4-6]，在超广谱β-内酰胺酶或头孢菌素酶与孔蛋白缺失的分离株中会出现假阳性结果，而在产NDM酶的菌株中会产生假阴性结果。有研究发现MHT检测NDM酶的敏感性为50%[4]，本研究产NDM酶的14株肠杆菌科细菌MHT均为阴性，不同临床实验室采用MHT检测NDM酶的敏感性的差异可能与判读标准有关。

由于MHT在检测上的局限性，2018年CLSI推荐mCIM联合eCIM作为新的碳青霉烯酶表型筛查方法[1]。mCIM操作简单，结果易解释，而且不受菌龄、药物敏感性试验纸片以及细菌是否产生黏液的影响[7]，在大多临床实验室都可以开展，比MHT有更高的敏感性和特异性[8]。本研究结果显示，MHT的敏感性为87.0%，mCIM的敏感性为100.0%，2种方法的特异性均为100.0%。

eCIM是辅助mCIM用于区分肠杆菌科细菌产丝氨酸碳青霉烯酶还是产金属β-内酰胺酶，可指导临床用药。新研制的内酰胺-内酰胺酶抑制剂组合（头孢他啶-阿维巴坦和美罗培南-法硼巴坦）以及其他正在开发的药物（亚胺培南/西拉他丁-瑞来巴坦）对大多数产丝氨酸碳青霉烯酶菌株都有效，但对产金属β-内酰胺酶菌株无效[9]。

eCIM检测肠杆菌科细菌的敏感性＞95%[1]，但本研究2株产IMP酶的菌株（1株肺炎克雷伯菌、1株产酸克雷伯菌）eCIM出现假阴性，EDTA终浓度调整到20 mmol/L仍为阴性结果。但有研究结果显示，在EDTA终浓度为0.1 mmol/L时，携带IMP酶的肠杆菌科细菌eCIM显示阴性，EDTA终浓度为5 mmol/L时，eCIM则为阳性[10]。本研究中出现假阴性结果的原因有待进一步研究。

与其他表型筛查方法一样，eCIM不能区分同时含有丝氨酸酶和金属酶菌株中的这2种酶。本研究中1株同时携带KPC和IMP的肺炎克雷伯菌，mCIM阳性，但eCIM阴性。

本研究涉及的菌株数量有限，只检测到3类碳青霉烯酶，其中主要为KPC和NDM。我国肠杆菌科碳青霉烯酶主要为KPC和NDM[11]，其他包括IPM、VIM和OXA-48在肠杆菌科临床分离株中较为少见[12]。本研究mCIM和eCIM检测KPC和NDM的敏感性和特异性均达到100.0%。

综上所述，采用mCIM筛查碳青霉烯酶比MHT更加敏感和特异，与eCIM联合使用可以区分丝氨酸酶和金属酶，可有效协助临床治疗CRE感染。