苗药铁筷子挥发油的化学成分分析及抑制BGC-823细胞增殖研究*

鲁 杰，谢 丹，阮婧华，范东生，查 鑫，辛加敏

(1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002；2贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001)

胃癌是一种死亡率极高的疾病，长期威胁人类的健康[1]，作为一种早期症状不明确的恶性肿瘤，通常采用化学疗法、放射疗法、生物学疗法等综合疗法来辅助，但这些方法对人体伤害均较大[2]，治疗后产生的副作用给患者的生活也带来极大的负面影响。越来越多的研究发现天然活性物质在抗肿瘤方面具有高效、低毒、高选择性、使用范围广的优点[3]，因此找出并利用抗胃癌活性且低毒副作用的天然活性物质成为现代研究领域的热点。

目前中药活性成分已被广泛应用于抗胃癌的研究中，中药挥发油作为中药活性成分中的一部分，有许多研究[4-8]表明，挥发油具有良好的抗肿瘤活性。现代研究发现，苗药铁筷子富含挥发油，具有抗炎、镇痛的药理作用[9-10]。苗药铁筷子为腊梅科蜡梅属植物腊梅Chimonanthuspraecox(L.)link.及山腊梅C.nitensoliv的干燥细根，收载于《中华本草·苗药卷》及2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中。作为贵州苗族的常用药[9]，苗药铁筷子具有祛风止痛、理气解毒的功效[11]，常用于风湿痹痛、风湿性关节炎的治疗。

本次试验对铁筷子挥发油抗肿瘤活性进行初步研究。本研究采用水蒸气蒸馏法提取铁筷子挥发油，并利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对铁筷子挥发油的化学成分进行检测，以及采用CCK8法对挥发油抗肿瘤活性的初步研究。本次研究以期为苗族特色药铁筷子抗胃癌提供思考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HP6890/5975C气相色谱质谱分析联用仪(美国安捷伦公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；全波段酶标仪。

1.2 试剂

正己烷(分析纯)；实验用水为哇哈哈纯净水；无水硫酸钠(分析纯)；铁筷子为贵州中医药大学第一附属医院中药房提供，由中药房陈秀敏主任药师鉴定，鉴定结果为腊梅科蜡梅属植物腊梅Chimonanthuspraecox(L.)link.及山腊梅C.nitensoliv的干燥细根。BGC-823 细胞购买于中国科学院上海细胞生物学研究所；DMEM培养基(美国Gibco公司，批号8119414)；新生牛血清(美国Gibco公司，批号SH40003.01)；青链霉素混合液(北京索莱宝有限公司，批号No.20171113)；CCK8试剂盒(北京索莱宝有限公司，批号CA1210)。

2 方法

2.1 铁筷子挥发油的制备[12-15]

取铁筷子药材100 g，加入5倍量的蒸馏水浸泡过夜，加入2 mL正己烷，按照水蒸气蒸馏法提取6 h，得具有特殊气味淡黄色油状物1 mL，经无水硫酸钠干燥即得铁筷子挥发油。

2.2 气相色谱条件

色谱柱为HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，初始温度70 ℃(保留2min)，以4 ℃·min-1升温至270 ℃，再以8 ℃·min-1升温至310 ℃(保留3 min)，汽化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压18.47psi，载气流量1.0 mL·min-1，分流比10∶1，溶剂延迟时间：6 min。

2.3 质谱条件

离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压2271 V；接口温度280 ℃；质量范围29～450 amu。

2.4 CCK8法检测细胞增殖作用

收集对数期生长的BGC-823细胞，调整细胞悬液浓度为1.0×104～1.5×104接种于96孔板，每个孔加入100 μL的细胞，边缘孔用无菌PBS填充，将96孔板放37 ℃含5% CO2的潮湿培养箱中培养24 h贴壁后，分成空白组、溶剂对照组、实验组、阳性药物组。空白组只加DMEM培养液，溶剂对照组加入含有DMSO的DMEM培养液，实验组为苗药铁筷子挥发油先用DMSO溶解，后用DMEM稀释成浓度为300 μL/mL、150 μL/mL、75 μL/mL、35 μL/mL、15 μL/mL。阳性药物卡培他滨用DMEM配制浓度为0 μL/mL、0.25 μL/mL、0.5 μL/mL、1.0 μL/mL、2.0 μL/mL、4.0 μL/mL。每个浓度设置6个复孔，每孔加100 μL。放培养箱37 ℃含5% CO224 h后，每孔加入10 μL的CCK8试剂，继续在培养箱中培养4 h后用酶标仪在450 nm处测定光密度OD值。空白调零孔，实验重复3次，取平均值，按下列公式计算细胞的增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100%

2.5 统计方法

3 结果与分析

3.1 铁筷子挥发油的化学成分气相色谱-质谱联用分析结果

铁筷子挥发油的化学成分气相色谱-质谱联用分析，化学成分总离子流程图见图1，铁筷子挥发油的化学成分及相对质量分数见表1。

图1 铁筷子挥发油成分的总离子流程图

表1 铁筷子挥发油成分及其相对质量分数

在苗药铁筷子挥发油提取过程中加入正己烷得油量最高，提取条件稳定，对总离提取率较高[16]。图中的各峰经质谱计算机数据检索及核对Nist14和Wiley275标准质谱图，确定了33种化合物，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数见表1。

3.2 CCK8检测苗药铁筷子挥发油对BGC-823细胞增殖抑制作用

苗药铁筷子挥发油对BGC-823细胞干预24 h，半抑制浓度IC50值为11.793 μg/mL；阳性药物卡培他滨对BGC-823细胞干预24 h，IC50值为1.098 μg/mL，阳性药物组与苗药铁筷子挥发油组对BGC-823细胞的增殖均有抑制作用，细胞的增殖抑制率与浓度呈相关性，与空白对照组比较，不同浓度的铁筷子挥发油对BGC-823细胞的增殖抑制率均有统计学意义(P<0.05)，见表2、表3。

表2 不同浓度铁筷子挥发油对BGC-823细胞的增殖抑制作用

表3 不同浓度阳性药物卡培他滨对BGC-823细胞的增殖抑制作用

4 讨论

从GC-MS分析结果可以看出，苗药铁筷子挥发油中主要含有棕榈酸、亚油酸、油酸、α-杜松醇等化合物。与已报道文献[17]相比，主要化合物成分相同，都检测出了棕榈酸、亚油酸、油酸、α-杜松醇。与文献[17]中苗药铁筷子挥发油的GC-MS检测结果比较，并没有检测出香橙烯、α-紫穗槐烯、吉玛烯、α-衣兰油烯、α-荜加油萜、广藿香醇、肉豆蔻酸、十五酸8个化合物，本次实验提取的挥发油检测出含有正己醛、2-庚酮、正庚醛、樟脑萜、月桂烯、4-异丙基甲苯、双戊烯、水杨酸甲酯、没药醇、桃金娘醇10个化合物。文献[17]中从铁筷子挥发油中共鉴定出了30种化合物结构，占总挥发油总量的96.81%，而本次研究从铁筷子挥发油中鉴定了33种化合物，共占挥发油的89.71%。检测的结果不同可能是由于药材产地、土壤条件、温度湿度、光照条件等环境因素的差异所造成的。苗药铁筷子挥发油中包括烃类、不饱和脂肪酸类、萜类化合物等，不饱和脂肪酸在防治心血管疾病方面效果显著[18]，萜类化合物在抗菌消炎镇痛方面具有很好疗效[19]。苗药铁筷子挥发油中含有烯烃类化合物，约占总体的7.36%，萜类化合物占总体的5.57%，有研究表明[20]，萜类化合物具有抗胃癌的活性的作用，但苗药铁筷子挥发油中具体是哪种化合物抑制BGC-823细胞的增殖以及抗肿瘤的机制还需进一步研究。初步实验结果表明，不同浓度的苗药铁筷子挥发油干预BGC-823细胞后呈现出增殖抑制作用(P<0.05)可能与苗药铁筷子挥发油对细胞的作用机制有关，并且这种作用对剂量具有明显的依赖性，可能是作用靶点在某种程度上参与了细胞的增殖过程，还有待进一步研究。本次研究并未对铁筷子挥发油在动物模型中作出阐述，今后需要进一步探讨。

综上所述，本研究对苗药铁筷子挥发油进行水蒸气蒸馏法提取，采用GC-MS联用对挥发油成分进行表征，并采用CCK8法检验了苗药铁筷子挥发油具有抗胃癌的活性，表明苗药铁筷子具有很大的药用利用价值和开发空间，但是目前对于铁筷子的研究较少，对铁筷子挥发油抗肿瘤成分、作用机制和作用细胞靶点尚未明确，对铁筷子挥发油的临床研究也很少，该药值得深入的研究与探讨。本次研究为进一步开展铁筷子挥发油体内抗胃癌作用和抗胃癌分子机制研究提供新思路，并为铁筷子这一苗药的合理开发和利用提供科学依据。