不同产地、不同品种玫瑰花多酚含量及抗氧化活性研究*

高嘉宁，张 丹，何海燕，黄田钫

(1中国科学院、水利部成都山地灾害与环境研究所，四川 成都 610041；2中国科学院大学，北京 100049；3中国科学院成都生物所，四川 成都 610041)

玫瑰花是蔷薇科多年生灌木植物玫瑰(RosarugosaThunb)的干燥花蕾或干花制品，是我国常用的一种花类中药材，具有疏肝醒脾、活血化瘀、抑菌抗癌、降脂降压的功效，是痛经灵颗粒、舒肝理气丸、十灵油、乳癖散结胶囊等30多种中成药的主要原料[1-2]。作为药食同源的中药材，玫瑰花除应用于临床药用和部分保健品外，生活中也常用新鲜玫瑰花或干花泡茶饮用，具有清热解毒、润肠通便、清爽提神、调经活血、促进代谢、增强免疫力和延年益寿等独特功效[3]。

玫瑰花化学成分复杂，含有维生素、蛋白质、氨基酸、挥发油、色素、多酚、黄酮和微量元素等多种成分[4-5]。研究发现，每100 g玫瑰花蕾中含有2 000 mg维生素C，其含量仅次于刺梨和金樱子，是中华猕猴桃的8倍，苹果的700多倍[6]。李铁纯等对比分析了干、鲜玫瑰花的挥发油物质含量，结果发现2种玫瑰花精油中的芳香成分存在明显差异，干花中醛类相对含量较高，而鲜花中酯类物质的相对含量较高[7]。近年来，对玫瑰花化学成分的研究主要集中在色素、黄酮、多糖和芳香成分的分离鉴定与药理活性方面，而对酚酸类物质含量及其抗氧化能力的研究相对很少报道[8-9]。植物多酚是一类结构复杂、化学性质活泼的化合物，在药理上具有显著的抑菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤效果[10-11]。研究发现，多酚不仅是一种强抗氧化剂，还可以协同胡萝卜素和维生素C、E等其他抗氧化物质清除许多与人体病理和生理疾病密切相关的自由基，如1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基和羟自由基(·OH)[12-13]。Nowak等研究发现玫瑰花蕾、叶中均含有丰富的酚酸类物质，对治疗和预防癌症、心血管疾病和老年痴呆症等现代慢性生理疾病具有良好的功效[14]。因此，本文对比分析了不同产地的7种玫瑰花多酚类物质含量，并对其抗氧化活性进行评估，为玫瑰花深度开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；UV-2754型紫外分光光度计(上海元析仪器公司)；Eyela型真空旋转蒸发仪(东京理化公司)；HQ-60涡旋混合器(东京理化公司)；Eyela Fd-1冷冻干燥机(东京理化公司)。

1.1.2 试剂

没食子酸、槲皮素和原花青素标准品均购买自上海麦克林生化科技有限公司，CAS号分别为149-91-7、117-39-5和4852-22-6。儿茶素标准品购自成都植标化纯生物技术有限公司，CAS号为154-23-4。鞣酸标准品购自上海安谱实验科技股份有限公司，CAS号为1401-55-4。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼购自北京鸿跃创新科技有限公司。其他试剂均购自中国食品药品检定研究院：甲醇、乙腈、甲酸、三氟乙酸为色谱纯，盐酸、无水乙醇、丙酮、正丁醇、十二水合硫酸铁胺、硫酸铁、邻二氮菲、过氧化氢溶液为分析纯，水为纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

2019年11月，在各玫瑰花种植基地内采用随机标记法采样，共收集样品30份，经鉴定均为蔷薇科蔷薇属玫瑰(Rose.rugosa)，样品的详细信息见表1。将采集的玫瑰花按自然晾晒风干或烘干(50 ℃)方式处理至恒重，粉碎过40目筛，实验备用。

表1 不同产地、品种玫瑰花样品信息

1.2.2 检测方法

儿茶素和没食子酸含量测定采用HPLC法，具体测定方法参照文献[15]：

1)色谱条件：Phenomenex luna C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长280 nm，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，进样量10 μL，流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱(0～42 min，A：30.0%～96.0%；43～45 min，A：96.0%～30.0%)。

2)对照品溶液制备：分别精密称定对照品0.1000 g，用甲醇配制成混合液。

3)线性关系考察：以标准品各组分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，以此来考察标准溶液的线性。结果显示，线性范围为0.1～200 μg/mL，相关系数0.998，精密度RSD为0.58%，重复性RSD为0.99%，定量限为0.05 μg/mL；没食子酸线性范围为0.1～200 μg/mL，相关系数0.998，精密度RSD为0.69%，重复性RSD为1.37%，定量限为0.05 μg/mL。

4)样品测定：称取0.2000 g玫瑰花粉末，依照1)色谱条件测定儿茶素和没食子酸含量。每个样品重复测定3次。

槲皮素含量测定采用HPLC法，具体测定方法参照文献[16]：

1)色谱条件：Phenomenex luna C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长280 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，流动相A为1%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱(0～42 min，A：4.0 %～60.0 %；42～43 min，A：60.0%～4.0%)。

2)对照品溶液制备：分别精密称定对照品0.50 g，用液氮研磨至粉末状，加入5 mL提取液(甲醇∶水∶甲酸∶三氟乙酸=70∶27∶2∶1)，制成混合溶液。

3)线性关系考察：根据实验色谱条件，记录峰面积，得到标准曲线和回归方程。结果显示，线性范围为0.1～200 μg/mL，相关系数0.999，精密度RSD为0.75%，重复性RSD为1.82%，定量限为0.06 μg/mL。

4)样品测定：称取适量玫瑰花粉末，依照1)色谱条件测定槲皮素含量。每个样品重复测定3次。

总原花青素含量测定采用紫外分光光度法，具体测定方法参照文献[17]：测定波长550 nm。线性范围为0～500 μg/mL，相关系数0.996，精密度RSD为2.17%，定量限为10.14 mg/mL。每个样品重复测定3次。

总鞣酸含量测定采用紫外分光光度法，具体测定方法参照文献[18]：测定波长276 nm。线性范围为0～200 μg/mL，相关系数0.999，精密度RSD为1.63%，定量限为0.025 mg/mL。每个样品重复测定3次。

DPPH·自由基清除率和·OH自由基清除率测定采用紫外分光光度法[19-21]：

1)DPPH·自由基清除率测定：精密吸取0.35 mg/mL的DPPH·储备液和1 mL的玫瑰花样品溶液，置于具塞瓶中避光反应0.5 h，于波长517 nm处测定吸光度值Am；吸取0.5 mL的DPPH·储备液和1 mL蒸馏水，反应后测定吸光度值A0；吸取0.5 mL无水乙醇和1 mL样品溶液，反应后测定吸光度值An。根据公式(1)计算DPPH·自由基清除率。

2)·OH自由基清除率测定：吸取玫瑰花样品溶液1 mL置于量瓶中，分别加入2 mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲液和1 mL 7.5 mmol/L的邻二氮菲溶液，再加入1 mL 0.1%过氧化氢溶液和1 mL 7.5 mmol/L的硫酸铁溶液，定容至10 mL，37 ℃水浴1 h，在波长510 nm处测定吸光度值A1；用水代替样品溶液，重复上述操作，测定A2；用水代替样品溶液和过氧化氢溶液，重复上述操作，测定A0。根据公式(2)计算·OH自由基清除率。

(1)

(2)

1.3 数据处理

数据采用SPSS22.0 软件进行方差分析(ANOVA)、Pearson相关分析和聚类分析(cluster analysis：CA)，采用Excel 2016 软件进行图表绘制。

2 结果与讨论

2.1 玫瑰花多酚含量

2.1.1 不同产地的玫瑰花多酚含量

不同产地玫瑰花儿茶素、没食子酸、槲皮素、总原花青素和总鞣酸含量见表2。由表2可知，不同产地玫瑰花儿茶素平均含量为4.34 mg/g，中位数为1.78 mg/g，变异系数Cv为106.9%；没食子酸平均含量为0.78 mg/g，中位数为0.57 mg/g，变异系数Cv为104.3%；槲皮素平均含量为62.95 mg/kg，中位数为58.65 mg/kg，变异系数Cv为56.4%；总原花青素平均含量为6.98 mg/g，中位数为7.21 mg/g，变异系数Cv为44.1%；总鞣酸平均含量为63.17 mg/kg，中位数为61.48 mg/kg，变异系数Cv为33.6%。由此可见，5种酚酸类物质的平均含量由高到低依次为总原花青素>儿茶素>没食子酸>总鞣酸≥槲皮素，含量变异系数由高到低依次为儿茶素>没食子酸>槲皮素>总原花青素>总鞣酸。

表2 不同产地玫瑰花多酚含量

统计分析的结果表明，山东平阴、吉林长白山和新疆和田玫瑰花儿茶素平均含量为9.41 mg/g，极显著高于其他产地(FCa=91.61，p<0.001)；山东平阴、云南昆明和新疆和田玫瑰花没食子酸平均含量为1.81 mg/g，极显著高于其他产地(FGa=49.59，p<0.001)；山东平阴、新疆和田和四川泸定玫瑰花槲皮素平均含量为104.59 mg/kg，极显著高于其他产地(FQu=29.36，p<0.001)；山东平阴、云南昆明、新疆和田、甘肃永登和陕西华县玫瑰花总原花青素平均含量为9.44 mg/g，极显著高于其他产地(FTPr=37.39，p<0.001)；甘肃永登、陕西华县和四川泸定玫瑰花总鞣酸平均含量为80.19 mg/kg，显著高于其他产地(FTTa=7.32，p<0.05)；山东平阴、吉林长白山和新疆和田产的玫瑰花总多酚平均含量为19.39 mg/g，极显著高于其他产地(FTP=36.73，p<0.001)。综上所述，山东平阴、新疆和田和吉林长白山玫瑰花多酚含量最高，其次是甘肃永登和陕西华县，四川泸定、云南昆明和云南丽江的含量最低，这种差异可能与区域气候、土壤等环境因子有关。研究认为经纬度、海拔、日照、年均温、降雨量、蒸发量和土壤肥力因子是影响植物多酚含量的主导环境因子[22-24]。同时，山东平阴和新疆和田是玫瑰花主要的产区，栽培模式、采摘与加工方法等都可能引起品质成分含量差异[25]。

2.1.2 不同品种的玫瑰花多酚含量

不同品种玫瑰花5种酚酸类物质含量如图1所示。由图1可以看出，不同品种的玫瑰花多酚含量存在显著差异。丰花、紫花重瓣和白花重瓣玫瑰的儿茶素平均含量分别为8.22 mg/g、11.46 mg/g和11.49 mg/g，其含量水平极显著高于其他品种(FCa=58.04，p<0.001)；金边和紫花重瓣玫瑰的没食子酸平均含量分别为2.38 mg/g和1.12 mg/g，其含量水平极显著高于其他品种(FGa=11.01，p<0.01)；大马士革、紫花重瓣、白花重瓣和苦水玫瑰槲皮素平均含量分别为91.95 mg/kg、75.03 mg/kg、53.83 mg/kg和58.49 mg/kg，其含量水平极显著高于其他品种(FQu=19.56，p<0.001)；苦水玫瑰的总原花青素平均含量为1.77 mg/g，其含量水平极显著低于其他品种(FTPr=9.06，p<0.01)；苦水、大马士革和白花重瓣玫瑰的总鞣酸平均含量依次为89.91 mg/kg、75.27 mg/kg和70.39 mg/kg，其含量水平极显著高于其他品种(FTTa=34.76，p<0.001)；紫花重瓣玫瑰的总多酚平均含量为20.68 mg/g，显著高于其他品种(FTP=7.12，p<0.05)，其次是白花重瓣、丰花、大马士革和金边玫瑰，平均含量分别为16.30 mg/g、14.26 mg/g、13.74 mg/g和13.13 mg/g，苦水和墨红玫瑰平均含量最低，分别为8.17 mg/g和3.33 mg/g。张訸等对比分析了4种玫瑰花中的多酚含量，结果发现墨红玫瑰的平均含量显著高于大马士革、滇红玫瑰和中国红1号玫瑰，与本文的研究结果存在一定差异，这可能与样品的提取和处理工艺有关[26]。研究发现，植物多酚能促进人体肠道微生物群中的有益菌的生长，并减少致病菌的数量[27]。南楠等研究认为，植物多酚是一种纯天然、无污染的抗生素替代物，在预防疾病和改善动物性能方面功效突出[28]。郑红梅等研究发现，植物多酚能显著抑制肉制品中的微生物生长，减缓脂肪氧化，有效延长肉制品的保质期[29]。本研究发现紫花重瓣玫瑰、白花重瓣和大马士革玫瑰的总多酚含量极显著高于其他品种，认为可能具有更广阔的市场开发潜力。

图1 不同品种玫瑰花多酚含量

2.1.3 聚类分析

聚类分析是指对研究对象的诸多特性或指标进行分类，同一类别因相似度较高则优先聚为一类[30]。为了探讨玫瑰花酚酸类物质含量与产地、品种间的关系，本文以儿茶素、没食子酸、槲皮素、总鞣酸和总原花青素含量作为样品的特征变量进行系统聚类分析(图2)。结果发现，当欧氏距离为10.00时，可将不同产地的玫瑰花分为两类，第Ⅰ类包括S8(甘肃永登，大马士革玫瑰)、S9(陕西华县，大马士革玫瑰)、S6(云南丽江，墨红玫瑰)、S1(甘肃永登，苦水玫瑰)、S5(云南昆明，金边玫瑰)和S10(四川泸定，大马士革玫瑰)；第Ⅱ类包括S3(山东平阴，紫花重瓣玫瑰)、S4(吉林长白山，白花重瓣玫瑰)、S2(山东平阴，丰花玫瑰)和S7(新疆和田，大马士革玫瑰)。

图2 不同产地、不同品种玫瑰花聚类分析

从产地的地理位置来看，除S7以外，第Ⅰ类的玫瑰花均产自我国西部地区，而第Ⅱ类产于我国东部沿海地区。研究表明，降雨量、光照强度、温度和蒸发量与植物多酚含量具有显著相关性，降雨量与多酚类物质含量呈负效应，而光强、温度和蒸发量越高，越有利于多酚类化合物的代谢与累积[31-33]。新疆属典型的温带大陆性气候，昼夜温差大，日照时间长，且降雨量少，从而导致产自新疆和田的大马士革玫瑰花多酚含量与其他产地的玫瑰花存在显著差异。从玫瑰花的品种来看，第Ⅰ类包含大马士革、苦水、金边和墨红玫瑰，因此可以认为它们具有相似的多酚类物质含量水平；而第Ⅱ类包含的丰花、紫花重瓣和白花重瓣玫瑰多酚含量极为相近。

2.2 玫瑰花抗氧化活性

2.2.1 DPPH·自由基清除率

自由基的增多是引发机体出现衰老、癌症和肿瘤的重要因素之一[34]。本文对不同品种玫瑰花DPPH·自由基清除率进行比较分析(图3(a))。结果发现，7种玫瑰花均能有效地清除DPPH·自由基，且清除率均为50%以上。其中，苦水、丰花、紫花重瓣、白花重瓣、金边和墨红玫瑰的清除率分别高达92.16%、89.80%、92.37%、91.92%、92.29%和92.28%。周小琦等研究玫瑰干花蕾对DPPH·自由基的清除活性，发现清除率达90.23%[35]。童周和甘露等对比分析了多种芳香类植物对DPPH·自由基的清除能力，结果发现，玫瑰花提取物的清除活性最强[36-37]。

从图3(a)可以看出，大马士革玫瑰花的DPPH·自由基清除率均值为71.91%，显著低于其它品种、品系玫瑰花的清除能力，且清除率随产地不同存在明显差异(p<0.05)。不同产地的大马士革玫瑰花对DPPH·自由基清除率由高到低依次为甘肃永登(86.07%)>新疆和田(81.85%)>陕西的华县(60.98%)>四川泸定(58.75%)。统计分析的结果表明，新疆和田和甘肃永登大马士革玫瑰花对DPPH·自由基清除率(均值为83.96%)极显著高于陕西华县和四川泸定(均值为59.86，p<0.001)。研究认为，DPPH·自由基的清除率主要与多酚、原花青素和黄酮等含量有关，而这些成分在很大程度上受产地地理环境的影响[38]。

图3 不同品种玫瑰花自由基的清除能力

2.2.2 ·OH自由基清除率

由图3(b)可知，不同品种玫瑰花对·OH自由基清除率由高到低依次为墨红(39.84%)>紫花重瓣(33.92%)>丰花(29.80%)>金边(27.00%)>苦水(26.73%)>大马士革(26.59%)>白花重瓣(26.35%)。不同产地的大马士革玫瑰花对·OH自由基清除率由高到低依次为新疆和田(29.06%)>四川泸定(26.86%)>陕西华县(26.15%)>甘肃永登(24.28%)。方差分析的结果发现，不同品种或产地的玫瑰花对·OH自由基清除能力均无显著差异性(p>0.05)。但从图3(b)可以看出，墨红玫瑰对·OH自由基清除能力最强，这与肖丽宏和张訸等人的研究结果一致，且在一定范围内，随浓度增加清除率逐渐增强[26，39]。宋宁珂等研究分析4种玫瑰花醇提物清除自由基的结果显示，丰花玫瑰清除·OH自由基的能力显著强于大马士革玫瑰花[40]。崔莉等对玫瑰花水提取物清除·OH自由基的研究显示，清除效果依次为紫花重瓣>丰花>墨红>大马士革[41]。

2.3 酚酸活性成分与抗氧化活性的相关分析

表3为不同酚酸类物质与2种自由基清除活性的Pearson相关分析。

表3 抗氧化活性与酚类成分相关系数

由表3可知，DPPH·自由基清除率与总鞣酸含量存在极显著负相关(p<0.001)，与槲皮素含量存在显著负相关(p<0.05)，·OH自由基清除率与总原花青素含量存在显著负相关性(p<0.05)。说明多酚类化合物对玫瑰花的抗氧化活性起着关键作用，其中，鞣酸、槲皮素和原花青素是其主要抗氧化成分，这与前人的研究结果一致[36]。同时，6种酚酸类物质含量间也存在一定相关关系。从表3可以看出，总原花青素与没食子酸和总多酚含量间存在极显著正相关性(p<0.001)，儿茶素与总多酚含量存在极显著正相关性(p<0.001)，没食子酸与总多酚含量存在显著正相关性(p<0.05)。

3 结论

研究发现，不同品种的玫瑰花5种酚酸类物质含量存在显著差异。其中，紫花重瓣玫瑰的总多酚平均含量最高，为20.68 mg/g；其次是白花重瓣、大马士革和丰花玫瑰，平均含量分别为16.30 mg/g、13.13 mg/g和12.36 mg/g；其余玫瑰花的总多酚含量相对较低。另外，产自山东平阴、新疆和田和吉林长白山的玫瑰花总多酚平均含量最高，分别为20.68 mg/g、21.20 mg/g和16.30 mg/g；其次是甘肃的永登和陕西的华县，平均含量分别为10.42 mg/g和9.31 mg/g。基于5种多酚类物质含量，聚类分析将玫瑰花明显分为两类，第Ⅰ类包含的品种有大马士革、苦水、金边和墨红玫瑰，均产自我国西部地区，认为它们具有相似的多酚类物质含量水平；第Ⅱ类包含的品种有丰花、紫花重瓣和白花重瓣玫瑰，均产自我国东部沿海地区，其多酚含量较为相近。初步认为，这种差异一方面受种质遗传因素的影响，另一方面产地的地理气候因子，如温度、光强、日照时间、海拔等也极大的影响了酚酸类代谢产物的积累。

不同品种的玫瑰花对DPPH·自由基和·OH自由基的清除率也存在显著差异。其中，紫花重瓣玫瑰对DPPH·自由基和·OH自由基清除率最高，分别为92.37%和33.92%；其次是墨红玫瑰、金边玫瑰和苦水玫瑰，对DPPH·自由基的清除率分别为92.28%、92.29%和92.16%，对·OH自由基清除率分别为39.84%、27.00%和26.73%；大马士革玫瑰花对自由基清除率最低，但依产地不同存在较大差异，其中以新疆和田的大马士革玫瑰花对2种自由基的清除率最高，分别为81.85%和29.06%。综合考虑，山东平阴的紫花重瓣玫瑰和新疆和田的大马士革玫瑰多酚含量较高，且对2种自由基的清除活性强，认为具有更大的市场开发潜力。