黔产道地金钗石斛不同部位多糖含量的测定*

杨婷婷，钟 可，黄芯琦，刘 珂

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)为兰科多年生草本植物，是珍稀名贵中药石斛的来源之一，具有滋阴养肾，清热生津的功效[1]。主要分布于我国贵州、四川、广西、云南和海南等省，在贵州主产于赤水市，有“赤水金钗石斛”之称，为道地药材[2-3]。金钗石斛化学成分有生物碱类、多糖、倍半萜、联苄、芴酮、酚酸、苯丙素、菲类、木脂素类化合物，多糖是金钗石斛主要活性成分之一[3-4]，现代药理研究发现多糖具有抗肿瘤、抗疲劳、降血糖、抗衰老、抗氧化等作用[5-7]，因此建立金钗石斛多糖有效、简便、可靠的测定方法有重要的实践意义。水提醇沉回流提取法是多糖常用传统提取方法[8]，苯酚-硫酸法也常用于多糖含量的测定。本实验选取贵州赤水金钗石斛为实验对象，通过正交设计对提取溶剂加入量、提取温度、提取时间、显色剂用量、显色反应时间进行考察，优选最佳提取条件及显色条件，确定金钗石斛多糖最佳测定方法。金钗石斛的传统药用部位为茎，目前研究也集中在金钗石斛茎，对金钗石斛花和叶的研究相对较少，市场上有金钗石斛花茶作为保健品使用，金钗石斛花和叶的开发利用具有极其广阔的市场前景。通过建立的方法对金钗石斛茎、花、叶中的多糖含量进行测定，可为金钗石斛的开发利用提供参考依据。

1 材料

实验所用12批金钗石斛药材均采自贵州省赤水市，北纬28°30′50″，东经105°52′43″，海拔510 m。均为仿野生栽培品，随机取样，样品来源见表1。经贵州中医药大学钟可副教授鉴定为兰科石斛属植物金钗石斛DendrobiumnobileLindl.。采收后的茎除去杂质，用开水略烫或烘软，再边搓边烘晒至叶鞘搓净，于烘箱60 ℃烘干；金钗石斛叶经洗净处理后，于烘箱60 ℃烘干；将金钗石斛花鲜品低温烘干。以上样品均粉碎过3号筛备用。D-无水葡萄糖(中国食品药品检定研究院，批号110833-201808，仅供国家药品标准检验用)，石油醚、无水乙醇、苯酚均为分析纯，浓硫酸；实验用水均为娃哈哈纯净水。紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司，UV-5900)；电热恒温鼓风干燥箱(上海博讯公司，GZX-9070MBE)；水浴锅(上海双捷实验设备有限公司，DRHH-S8)；超声机(上海乔跃电子有限公司，JOYN-10A)；十万分之一天平(日本岛津公司，ADW120D)、万分之一天平(梅特勒-托利多上海有限公司，ME204E)。

表1 样品来源表

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制

以蒸馏水为空白，分别各精密量取浓度为0.10 mg/mL的葡萄糖对照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL，置10 mL具塞试管中，加水至1.0 mL，精密加入临用配制的5%苯酚溶液l mL，再精密加4 mL硫酸，摇匀，于90 ℃水浴锅中加热15 min，取出试管冰浴冷却5 min。以蒸馏水为空白，按照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在488 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为A=9.33x+0.0355，r2=0.999。

2.2 紫外检测波长的确定

精密量取葡萄糖对照品溶液0.5 mL于10 mL具塞试管中，精密加入0.5 mL蒸馏水，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入浓硫酸4.0 mL摇匀，置90 ℃水浴中加热15 min后取出并冰浴5 min后，并以蒸馏水为空白对照，按照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在200～800 nm波长范围内进行扫描，测得葡萄糖对照品最大吸收峰在488 nm波长处。扫描结果见图1。

图1 紫外波长扫描结果

2.3 正交设计优选多糖显色条件与提取工艺

2.3.1 显色条件

通过L9(34)正交实验，对苯酚与浓硫酸的加入量和反应时间进行考察，以吸光度为指标确定最佳加入量与反应时间。

分别精密量取葡萄糖对照品溶液0.5 mL置于10 mL具塞试管中，共9份，精密加入0.5 mL蒸馏水，再加入临用配置5%苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸，摇匀，置90 ℃水浴中加热不同时间后，取出冰浴5 min，于488 nm波长处测定吸光度。因素水平见表2，正交实验结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 显色条件试验因素

表3 显色条件正交试验结果

表4 方差分析结果

直观分析可知，各因素对吸光度的影响顺序为A>C>B，方差分析结果发现A、B、C均无显著性影响(P>0.05)。综合直观分析及方差分析，选取反应条件为A2B1C1时，即苯酚用量为1.0 mL，浓硫酸用量为4 mL，反应时间为15 min时，吸光度最高。

2.3.2 提取方法

根据多糖性能选用水提醇沉法进行金钗石斛多糖的提取条件考察，选择提取溶剂加入量、提取温度、提取时间3个试验因素，选用L9(34)正交表对金钗石斛进行石斛多糖的提取与测定，多糖百分含量作为考察指标。

分别称取金钗石斛茎粉末0.15 g于250 mL圆底烧瓶中，共9份。各加10 mL石油醚回流脱脂1 h，过滤挥干溶媒。药渣用10 mL 80%乙醇回流除杂 1 h，过滤水浴挥干。药渣用不同量的蒸馏水按照不同温度分别提取不同时间，趁热过滤，定容至250 mL容量瓶中，摇匀，因素水平表见表5。将分别所得金钗石斛供试品溶液，精密吸取0.5 mL于具塞试管中，精密加入0.5 mL蒸馏水，按“2.3.1”所得的最优条件反应，测得吸光度，分别代入“2.1”项所得的回归方程，计算多糖浓度。实验结果见表6。并以多糖百分含量作为衡量提取效率的客观指标，优选最佳提取工艺。方差分析结果见表7。

表5 提取条件试验因素表

表6 提取条件正交试验结果

表7 方差分析结果

由直观分析可知，各因素对多糖含量的影响顺序为A>B>C，方差分析结果表明，A、B、C对提取的多糖浓度无显著性影响(P>0.05)。结合直观分析结果，最佳反应条件为A2B2C3时，即提取温度为100 ℃，加水量为150 mL，提取时间为2 h的条件下，提取的多糖百分含量最高。

2.4 供试品溶液制备及反应条件的确定

称取样品粉末0.15 g，置于250 mL圆底瓶中，加10 mL石油醚回流提取1 h，过滤后挥干溶媒；再加入10 mL 80%乙醇回流1 h，过滤水浴挥干，用150 mL的蒸馏水在100 ℃下回流提取2 h，过滤，残渣用蒸馏水洗涤，定容至250 mL容量瓶中，摇匀即得供试品溶液。最佳显色反应条件为：取供试品溶液0.5 mL，置10 mL具塞试管中，再加0.5 mL水补至1 mL。取临用配置5%苯酚溶液l mL，再精密加浓硫酸4 mL，摇匀，于90 ℃水浴锅中加热15 min，取出试管冰浴冷却5 min，在488 nm处测定吸光度。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

分别准确量取浓度为0.10 mg/mL的葡萄糖对照品溶液共6份，按“2.4”项下操作，测定对照品溶液吸光度，RSD为1.6%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验

精密称取同一批金钗石斛样品6份，每份约0.15 g，按“2.4”项下操作，测定每份样品吸光度，计算多糖的含量为20.14%，RSD为1.83%，表明方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验

精密称取金钗石斛样品粉末0.15g，按“2.4”项下操作，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h测定其吸光度，其RSD为1.56%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 加样回收率试验

精密称取已知多糖百分比含量为20.14%的金钗石斛茎粉末6份，每份约0.075 g，分别精密加入与样品中多糖含量相等的D-无水葡萄糖对照品，按“2.4”项下操作，测定样品吸光度结果见表8，其RSD为1.32%，平均回收率为100.68%，均符合要求。

表8 加样回收率试验结果

2.6 样品中多糖含量测定结果

按“2.4”项下操作，以蒸馏水为空白，对12批样品进行多糖含量的测定，多糖的百分含量结果见表9。

表9 样品多糖含量测定结果(n=2)

由测定结果可知，12批样品中，金钗石斛茎中多糖含量最高，为21.88%，茎、花、叶中多糖含量表现为：茎>叶>花。

3 讨论

实验通过正交设计对金钗石斛多糖提取条件以及显色条件进行考察优选。以多糖百分含量为指标，确定最优提取条件为：加入蒸馏水150 mL沸腾后回流提取2 h；以吸光度为指标，最佳显色条件为：加入苯酚1 mL、浓硫酸4 mL，于90 ℃水浴锅中加热15 min，取出试管后冰浴冷却5 min。建立的方法操作简便，易控制，稳定性及精确度高，多糖的得率较高。金钗石斛多糖提取方法多种，如曾雨馨等[8]对金钗石斛多糖超声提取方法进行了优化，荆晶等[9]对微波辅助提取法进行了优化，还有酶解辅助提取法等[10]，但多糖经过超声或微波处理后其糖苷键可能会发生断裂，酶解辅助提取法中酶反应条件要求严格，成本较高[7]。水提醇沉回流提取法一直是金钗石斛多糖常用的传统提取方法，苯酚-硫酸法也常用于多糖含量的测定，水提法[11-13]目前亦有提取工艺的优化，但对苯酚-硫酸法显色条件的考察较少。本实验在对水提法的提取工艺优化的同时，对显色条件也进行了优选，建立的方法可适用于金钗石斛多糖含量的测定。通过实验建立的方法，对金钗石斛不同部位多糖的含量进行了测定，金钗石斛的传统药用部位为茎，实验结果也表明了茎中多糖含量高于叶与花，但金钗石斛叶与花中亦有较高的多糖含量，可为金钗石斛的开发利用提供参考依据。