反复喘息婴幼儿外周血单核细胞中T-bet/GATA-3比值与潮气呼吸肺功能及Th1/Th2细胞平衡的关系

陈国华 黄为民 潘志伟 白 珺

1.南方医科大学第一临床医学院附属佛山市妇幼保健院儿科，广东佛山 518000；2.南方医科大学第一临床医学院南方医院新生儿科，广东广州 510515

喘息性疾病病因复杂，免疫及炎症反应失衡是其发生的核心环节[1]。辅助T 细胞（Th）是免疫调控因子，其中Th1 特征性分泌γ 干扰素（IFN-γ）；Th2 细胞特征性分泌白细胞介素-4（IL-4），Th2 细胞优势分化是气道炎症启动的关键[2]。T-bet、GATA-3 是机体调控Th 细胞分化的转录因子，T-bet 能够促进Th1 细胞的分化，GATA-3 则能促进Th2 细胞的形成，T-bet/GATA-3 比值可能是反映机体Th1/Th2 分化平衡的指标之一[3]。可通过检测潮气呼吸肺功能评估婴幼儿喘息性疾病肺功能，且评估准确性较高[4]。现阶段关于T-bet/GATA-3 比值和反复喘息患儿潮气呼吸肺功能及Th1/Th2 细胞的关系尚未可知，鉴于此，本研究探讨三者之间的关系，以期为婴幼儿喘息的诊疗提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018 年1 月—2019 年12 月南方医科大学第一临床医学院附属佛山市妇幼保健院随诊的反复喘息婴幼儿120 例为喘息组，其中男73 例，女47例；年龄12～36 个月，平均（23.25±7.82）个月；体重7～15 kg，平均（9.87±4.35）kg。纳入标准：①反复喘息经病史、体格检查及胸片等确诊；②反复喘息婴幼儿表现为反复咳嗽且肺部有鸣音。排除标准：①支气管或肺发育不良、先天性心脏病、气管异物或发育畸形、胸廓畸形及早产儿；②免疫调节类药物应用史。另选择同期体检健康婴幼儿60 名为对照组，其中男36 例，女24 例；年龄12～36 个月，平均（23.58±7.43）个月；体重8～15 kg，平均（9.66±4.48）kg。两组性别、年龄、体重比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。入组婴幼儿家长知晓且签署相关资料，本研究经医院伦医学理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 T-bet、GATA-3 的检测 抽取入组婴幼儿清晨空腹静脉血5 mL（2 份）。1 份经1500 r/min 离心10 min（离心半径14 cm），分离血清置于-20℃冷藏器中备用。另1 份按常规淋巴细胞分层密度离心法分离出单核细胞。严格按照试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP419]操作说明，提取单核细胞中的总RNA，使用RT Kit 试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：RR037A]将RNA 反转录为cDNA，随后使用LightCycler96 荧光定量PCR 仪进行qRTPCR 扩增反应，反应条件为95℃预变性3 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，共40 个循环，最后72℃延伸10 min。操作按照反转录试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：RR047A]说明书进行。计算T-bet、GATA-3 的相对表达量及比值。T-bet 引物（上游：5’-TGGTCCAAGTTTAATCAGCACCAG-3’，下游：5’-CCCGGCCACAGTAAATGACAGG-3’）和GATA-3 引 物（上游：5’-CCTCATTAAGCCCAAGCGAAG-3’，下游：5’-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3’），β-actin 正向引物序列为5’-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3’，反向引物序列为5’-AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG-3’，引物均由北京博尔迈生物技术公司（北京）提供。

1.2.2 Th1、Th2 细胞的检测 检测采用流式细胞术，单核细胞经磷酸盐缓冲液液清洗-稀释至1×106个/mL，后进行细胞培养（6 h）-磷酸盐缓冲-室温孵育-重悬，最后经流式细胞仪收集并分析Th1、Th2 细胞比例，计算Th1/Th2 比值。

1.2.3 IFN-γ、IL-4 的检测 严格按照检测试剂盒操作说明，酶联免疫吸附试验检测血清中IFN-γ、IL-4水平，所有试剂盒购于美国贝克曼公司（货号：2125813、2508024）。

1.2.4 潮气呼吸肺功能的检测 采用肺功能仪对入组婴幼儿进行潮气呼吸肺功能检测，检测指标包括：呼吸频率（RR）、潮气呼吸呼气峰流速（PTEF）、潮气量（VT）、达峰时间比（TPTEF/TE）、达峰容积比（VPEF/VE）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson 相关分析。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组T-bet、GATA-3 比较

喘息组T-bet 和T-bet/GATA-3 比值明显低于对照组，而GATA-3 明显高于对照组（均P ＜0.01）。见表1。

表1 两组T-bet、GATA-3 比较（±s）

表1 两组T-bet、GATA-3 比较（±s）

2.2 两组潮气呼吸肺功能比较

喘息组RR、PTEF 水平明显高于对照组，而VT、TPTEF/TE、VPEF/VE 明显低于对照组（均P ＜0.01）。见表2。

表2 两组潮气呼吸肺功能比较（±s）

表2 两组潮气呼吸肺功能比较（±s）

注：RR：呼吸频率；VT：潮气量；TPTEF/TE：达峰时间比；VPEF/VE：达峰容积比；PTEF：潮气呼吸呼气峰流速

2.3 两组Th1、Th2 及相关细胞因子比较

喘息组Th1、Th1/Th2、IFN-γ 水平明显低于对照组，而Th2、IL-4 水平明显高于对照组（均P ＜0.01）。见表3。

表3 两组Th1、Th2 及相关细胞因子比较（±s）

表3 两组Th1、Th2 及相关细胞因子比较（±s）

注：Th：辅助性T 细胞；IFN-γ：γ 干扰素；IL：白细胞介素

2.4 相关性分析

Pearson 相关性分析显示，反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3 比值与VT、TPTEF/TE、Th1/Th2 呈正相关（r=0.741、0.567、0.762，P ＜0.01），与RR 呈负相关（r=-0.717，P ＜0.01）。见图1。

3 讨论

喘息常见于儿童时期，其发生率明显高于其他年龄段[5]，其原因复杂多样，免疫缺陷、淋巴结核等均可导致喘息的发生，其病因诊断较为困难，预后差别较大[6-8]。因此，探索婴幼儿反复喘息的发病机制、采取有效干预对改善患儿预后至关重要。

图1 反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3 比值与潮气呼吸肺功能和Th1/Th2 的相关性分析结果

T-bet 最初由小鼠Th1 细胞株的cDNA 文库中克隆而来，其与鼠类的T-bet 在氨基酸水平的同源性高达88%[9]。小鼠的T-bet 基因与气道高反应基因相连锁，据此推测，人类T-bet 基因可能与气道高反应性疾病基因密切相关[10-11]。GATA-3 可调控免疫细胞的分化及炎症因子的表达，故GATA-3 可能与婴幼儿喘息性疾病密切相关[12-13]。唐闻琼等[14]发现反复喘息婴幼儿T-bet/GATA-3 比值显著降低，且T-bet/GATA-3比值下降与患儿潮气肺功能的损害有紧密联系，提示T-bet、GATA-3 失衡与喘息性疾病密切相关。肺功能检测是评估喘息病情的重要指标，但婴幼儿无法配合检查，无法开展呼气肺功能检测[15]。而RR、TPTEF/TE、VPEF/VE 等指标可较好地反映气道阻塞情况，且只需患儿平静呼吸、无需配合[16]。本研究结果显示与对照组比较，喘息组T-bet、T-bet/GATA-3 比值、VT、TPTEF/TE、VPEF/VE 明显降低，GATA-3、RR、PTEF明显升高（均P ＜0.01）；而T-bet/GATA-3 比值与VT、TPTEF/TE 呈正相关，与RR 呈负相关（均P ＜0.01）。提示T-bet/GATA-3 比值的下降与患儿潮气肺功能的减弱具有密切的关系，可能是由于T-bet/GATA-3的紊乱，引起IL-4、IL-5 等炎症因子分泌增多及气道高反应，进而导致气道炎性增、阻塞，最终引起潮气肺功能的减弱[10-12]。

细胞因子由免疫效应细胞分泌，其参与抗原的呈提、炎症细胞的激活等环节[17]。目前，参与喘息性疾病进展的细胞因子超过10 种，其中以IFN 和IL 最为重要，二者对气道炎症反应具有重要的调控作用[18]。Th1细胞和Th2 细胞来源于同一Th 前体细胞，正常情况下Th1 和Th2 细胞分化均衡，在机体中形成复杂有序的网络以维持正常免疫应答[19]。Th1 细胞特征性分泌IFN-γ，进而抑制Th2 细胞的分化，拮抗Th2 细胞因子（IL-4）依赖型IgE 免疫球蛋白的产生，减少抗原所致的气道炎症浸润[20-21]。Th2 细胞特征性分泌IL-4，进而上调血管间黏附分子、C-C 趋化因子及选择素的表达，激活炎症细胞释放炎症介质，导致气道炎症和气道高反应性的发生[22]。Th 前体细胞分化方向受T-bet和GATA-3 的调控[23]，T-bet 能够促进Th1 细胞的分化；而GATA-3 促进Th2 细胞的分化，减少IFN-γ 的生成[24-25]。因此，T-bet 和GATA-3 的检测可评估机体Th1、Th2 细胞的分化平衡情况。本研究结果显示，与对照组比较，喘息组Th1、Th1/Th2、IFN-γ 明显降低，而Th2、IL-4 明显升高（均P ＜0.01）；且T-bet/GATA-3比值与Th1/Th2 呈正相关（P ＜0.01）。提示T-bet/GATA-3 比值可较好地反映Th1/Th2 细胞失衡情况，原因在于T-bet 的下降减弱了Th1 细胞的分化，而GATA-3 的升高加强了Th2 的增殖，导致Th1/Th2 下降[9,26-27]。此外，IFN-γ 的降低、IL-4 的升高，说明T-bet/GATA-3 比值下降对Th1/Th2 细胞因子分泌的失衡起到促进作用，IFN-γ 的气道保护作用降低而IL-4的促炎效应增强，进而导致气道高反应及过度炎症反应，引发婴幼儿反复喘息的发作。

综上所述，反复喘息婴幼儿外周血单核细胞中T-bet/GATA-3 比值下降，且与患儿潮气肺功能及Th1/Th2 细胞介导的免疫失衡密切相关，可能为反复喘息婴幼儿的诊疗提供新思路。