当归芍药散优化方抗慢性盆腔炎的实验研究

刘 敏 王小燕 贾瑞琳 任存霞

内蒙古医科大学中医学院，内蒙古呼和浩特 010059

慢性盆腔炎（CPID）是女性上生殖道及其周围结缔组织的感染，包含子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔腹膜炎等，是一组炎症性疾病。流行病学调查显示，盆腔炎性疾病发生对象以20～35 岁年轻的育龄期女性为主，是影响现代女性生活质量的一大棘手问题。本病还与性文化、性教育、社会发展、婚姻道德观等因素密切相关[1-2]，若失治、误治给个人、家庭以及社会带来的影响是难以预估的。当归芍药散方出自《金匮要略》，研究报道该方对女子经、带、胎、产在内的诸多病症均见疗效[3-5]，是中药治疗盆腔炎性疾病的经典处方之一。本实验前期[6-8]结果提示，当归芍药散可通过改善机体免疫来达到抗炎抗粘连作用；原方组成优化取芍药、川芎、泽泻、茯苓、白术剂量比为10∶5∶5∶4∶4 时其抗CPID 效果较佳。赤瓟子善治血瘀胞宫、经闭、胎衣不下等妇科病，对血脉病、疮痈、筋骨疼痛等多病种有效[9-11]，是蒙医妇科疾病经典用药。赤瓟子还具有镇痛、抗炎、抑制肿瘤等多种药理作用[12]。本实验采用经方优化药味联合经典蒙药的模式，探索新方对CPID大鼠的治疗作用，以期为临床抗CPID 药物的研发提供思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

微量高速离心机（型号：TG16W）；酶标仪：北京普朗新技术有限公司（型号：DNM-9602）；光学显微镜：日本尼康公司（型号：Eclipse E200）。HE 染液试剂，北京博奥拓达科技有限公司（批号：20170916）。ELISA试剂盒：北京博奥森生物技术有限公司[白细胞介素-1β（IL-1β）货号：DRE20024；IL-10 货号：DRE20095；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）货号：DRE20040]。金刚藤胶囊：湖北福人药业公司产，0.5 g/粒（批号：20171016）。混合细菌溶液：内蒙古医科大学微生物室培育，将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌制成比例为2∶1∶1 浓度约为3×109个/mL 混悬液。

1.2 方法

1.2.1 动物及分组 70 只SPF 清洁级SD 雌性大鼠，体重180～220 g，设置正常组，模型组，金刚藤胶囊组，蒙药赤瓟子组，新方高、中、低剂量组，每组10 只，由内蒙古大学动物研究中心培育[许可证号：SCXK（蒙）2001-0001]。

1.2.2 CPID 模型复制 大鼠标号、称重，腹腔注射麻醉，取腹直线与耻骨联合交点直上1 cm 处为切口，暴露出大鼠“Y”型子宫。配好的混合细菌分别注入两侧宫腔内，每侧0.1 mL 量，同时用利器尖端划伤子宫内膜，完成操作后缝合腹腔。CPID 造模成功标准：肉眼观察宫腔与周围结缔组织粘连，可见宫腔积液；镜下观察子宫病理切片，内膜缺损，可见脱落、坏死细胞，腺体萎缩、减少，间质内可见大量炎症细胞浸润等。

1.2.3 给药 新方按3∶10∶5∶4∶4∶5 配比依次称取赤瓟子10 g、芍药30 g、川芎15 g、白术12 g、茯苓12 g、泽泻15 g，临床用量94 g/d，以成人体重（60 kg）为标准，得出给药量为1.57 g/kg，大鼠等效剂量换算约为成人6.3 倍[13]，新方高、中、低剂量组分别以12.6、6.3、3.15 倍药量换算，含生药量分别为19.74、9.87、4.93 g/kg，按10 mL/kg 为给药体积，得出高剂量组药液为1.97 g/mL，按需配制其他剂量组。金刚藤胶组：临床每天药量为6 g，同法得出6.3 倍等效药量即0.63 g/kg，大鼠灌胃给药体积不变，得出金刚藤胶囊药液为0.06 g/mL（即0.5 g 配液8 mL）。蒙药赤瓟子组：常规量10 g/d，同法算出等效药量为1.04 g/kg，配置药液是0.10 g/mL。

1.3 观察指标

血清学：大鼠腹主动脉血3～5 mL，静置30 min后离心（转速3500 r/min），取上清液在室温下酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法测定血清IL-1β、IL-10、TNF-α。组织学：双侧子宫标本于15 mL 中性甲醛溶液固定。脱水硬化处理、石蜡包埋、切片（4～6 μm）、HE 染色。显微镜下观察大鼠宫腔壁结构、腺体排列、炎症细胞侵润情况，上述观察指标进行病理学评分，设置4 个病变程度为无（-）、轻（+）、中（++）、重（+++），依次计0、1、2、3 分[14]。见表1。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组均数比较选方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 法或Dunnett T3法。计数资料以例数表示。等级资料用非参数秩和检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 子宫结构病变程度评价

2 结果

2.1 子宫组织病理学观察

光学显微镜下观察，正常组子宫腔结构完整，内膜层组织形态正常，腺体排列有序，基底层致密、纹理清晰（图1a）；模型组子宫黏膜层变薄，内膜变形缺损，可见有脱落、坏死细胞，腺体萎缩，子宫全层可见炎性浸润（图1b）；金刚藤胶囊组可见散在炎症细胞浸润（图1c）；新方高剂量组见内膜增生样改变，基底层致密，腺体结构完整，视野内炎症细胞浸润少（图1d）；新方中剂量组可见腺体排列较完整，少量炎症细胞浸润（图1e）；新方低剂量与蒙药赤瓟子组可见脱落、坏死细胞，腺体萎缩，黏膜层损坏，炎症细胞大量浸润（图1f、1g）。病理学评分显示：与正常组比较，模型组子宫病理学积分显著升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。金刚藤组、新方高、中剂量组病理积分较模型组降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

2.2 各组大鼠血清IL-1β、IL-10、TNF-α 比较

图1 各组子宫组织HE 染色（40×）

表2 各组子宫病理学积分比较（例，n=10）

与正常组比较，模型组IL-10 含量降低，IL-1β及TNF-α 含量升高，差异有统计学意义（P ＜0.05），提示CPID 造模成功。与模型组比较，新方高、中剂量组IL-10 含量升高，新方高中、中、低剂量组IL-1β 与TNF-α 含量降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与金刚藤组比较，新方低剂量组IL-10 降低，IL-1β 升高，新方高、中剂量TNF-α 含量降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与蒙药赤瓟子组比较，新方高、中剂量IL-10 升高，IL-1β 降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-1β、IL-10、TNF-α 比较（±s，n=10）

表3 各组大鼠血清IL-1β、IL-10、TNF-α 比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与金刚藤组比较，cP ＜0.05；与蒙药赤瓟子比较，dP ＜0.05。IL：白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子α

3 讨论

CPID 属中医“带下”“腹痛”病范畴，是由瘀与湿侵犯引起的“血水同病”，当归芍药散药物组成特点恰为“肝脾同调，血水同治”，方随证立，临床报道证实该方治疗CPID 取得显著效果[15-17]。蒙医学认为赫依运行紊乱，瘀血、黄水、黏热或寒邪相互搏结可引发CPID，临床上蒙药联合西药能够有效改善CPID 症状、降低经济成本、减少复发率[18-21]。近年来，针对盆腔炎性疾病的防治是妇科领域研究的热点与难点，单纯采用西药、中药或蒙药的治疗模式已经不能满足临床日益增长的需求。因此，联合用药将会是防治CPID的更优选择[22-23]。

CPID 的发生与炎症因子的异常表达有关，慢性病程阶段的病理改变也是由异常的免疫应答所致[24-25]，本研究选取TNF-α、IL-1β 及IL-10 3 个相关细胞因子进行研究。TNF-α 过度分泌会诱导其他炎症介质的异常表达，促使炎症持续反应并引起组织受损。TNF-α 还可诱导细胞间黏附分子大量聚集，加速组织的增生与粘连。IL-1β 主要介导组织破坏与水肿，IL-1β高表达提示机体存在感染与损伤。IL-10 能发挥抑制炎症作用，可抑制TNF-α、IL-1β 等促炎症因子合成与释放，缓解炎症。本实验结果显示，模型组血清IL-10含量减少，TNF-α、IL-1β 含量均升高，新方高、中剂量组与金刚藤组IL-1β 含量降低，IL-10 含量升高，提示以上用药组可有效抑制促炎因子表达、升高抗炎因子表达，对紊乱的炎症因子具有一定调节作用，对CPID 起到积极治疗作用。除金刚藤胶囊组外，各给药组明显降低TNF-α 含量，提示新方与蒙药赤瓟子可改善CPID 局部组织粘连情况。新方对CPID 模型大鼠可发挥治疗作用机制可能与上调IL-10 因子表达，下调TNF-α、IL-1β 因子表达相关。