FSHR基因第10外显子SNP的筛选及其与兔体质量性状的关联性分析

石 宇，卿恩华，赖秀兰，胡深强，贾先波，王 杰，赖松家

（四川农业大学“畜禽遗传资源发掘与创新利用”四川省重点实验室，四川 成都 611130）

促卵泡素受体（Follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）[1]是促卵泡素（Follicle-stimulating hor‑mone，FSH）的特异性受体[2]，FSH-FSHR 能够调控两性性腺的发育及功能[3-4]。近年来，在非性腺组织[5-8]也检测到了FSHR基因的表达，提示FSHR基因可能介导FSH 信号调控更多的生理活动。值得注意的是，FSHR基因在脂肪组织和细胞中均有表达[9-10]。研究发现，FSH 与FSHR 结合，作用于Gαi/Ca2+/CREB信号通路，激活下游基因的表达，进而促进了脂质合成以及脂肪的沉积[10]。Liu等[11]利用FSH抗体竞争性结合小鼠体内的FSH，阻断了FSH-FHSR 介导的信号传递通路，解除了FSH 对Ucp1 基因的抑制作用，结果导致小鼠体内棕色脂肪的生成增多，白色脂肪的沉积减少，整体脂肪减少；敲除小鼠FSHR基因得到类似的结果。在有关绝经女性的研究中，肥胖女性的FSH 水平更低[12-13]。另外，王亚男[14]在京海黄鸡FSHR基因的第1外显子和第10外显子分别发现错义突变C159T 和C75429T，对FSHR基因的多态性与京海黄鸡的繁殖性状和生长性状关联性分析发现，C159T位点的AA，AB和BB基因型个体在2周龄、6周龄体质量存在显著差异；C75429T 位点CD 基因型个体6 周龄体质量显著高于CC 基因型。以上研究表明FSHR介导FSH信号调控机体脂肪沉积，且与体质量存在一定的关联。

目前，研究发现FSHR基因能够将FSH信号传递到多个信号通路，进而调控多种细胞活动。FSHR基因也被证实与脂肪沉积和体质量水平存在一定的关联，但其是否影响兔早期体质量性状还未见报道。天府黑兔是四川地区广泛饲养的一个肉兔品种，具有繁殖能力强、生长速度快等特点[15]。本研究采用PCR 产物直接测序的方法对天府黑兔FSHR基因第10 外显子的SNP 进行了分析，比较了不同SNP 位点上各基因型个体间42、49、56 及70 日龄体质量的差异，以期了解FSHR基因的功能以及为兔早期体质量选择提出新的分子标记。

1 材料和方法

1.1 试验材料

天府黑兔来自四川农业大学教学科研兔场，共100只。由专人饲养，保证营养、管理水平一致。称量记录其42、49、56以及70日龄体质量。称量结束后，统一采集耳组织样，置于含有75%酒精的EP管中并立即带回实验室，-20 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 兔耳组织DNA 的提取 用眼科剪将带回的耳组织上的兔毛除去，然后按照动物基因组DNA 提取试剂盒（擎科梓熙生物技术有限公司，中国）对全基因组DNA 进行提取，详细步骤参照试剂盒说明书进行，提取到的DNA样品加入适量ddH2O稀释并做好标记，-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计 通过NCBI在线数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），获得家兔（Oryctolagus cuniculus）FSHR基因（GeneID：100343287）第10外显子的序列，利用primer premier 6设计扩增引物F：TCAAGGGCAGA‑CAAGAT；R：GAGCACAAGGAGGAACA，最后由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.2.3 PCR 扩增 PCR 扩增总体积为10 µL，其中包括0.5 µL 上游引物（10 pmol/µL），0.5 µL 下游引物（10 pmol/µL），5.0µL 2×TaqMasterMix，3µL ddH2O以及1µL DNA模板。PCR扩增程序为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，59.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，最后72 ℃总延伸10 min，4 ℃保存。将PCR产物做好标记后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行PCR直接测序。

2 数据分析

2.1 基因频率和基因型频率

根据测序结果，判断每个样本在每个突变位点的基因型，经简单计算，得到样本群体各位点的基因型频率及基因频率。

2.2 FSHR基因遗传多样性分析

利用在线软件PopSc calculatorhttp://popsc.chenshiyi.com/计算群体平均杂合度（Expected heterozygosi‑ty，He）以及多态信息含量（Polymorphism information content，PIC）；利用IBM SPSS®Statistics 计算Hardy-Weinberg平衡的卡方值。

2.3 基因型与体质量性状的关联性分析

利用SAS 9.21（SAS institute inc，version 9.21）中的GLM 程序对各位点不同基因型个体间体质量性状的差异进行显著性检验，构建基因型效应统计分析模型：

式（1）中，yijk为个体体质量性状的观测值；μ为群体体质量均值；Gi为基因型效应；Sj为性别的效应；（G×S）ij为基因型与性别的交互作用；eijk为随机误差效应。

3 结果与分析

3.1 FSHR基因突变位点的检测

PCR 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测可得到清晰的特异性条带（图1），与预期产物长度893 bp 的结果一致。利用dnastar 7.1中的SeqMan 软件对100 个样本测序结果进行整理和比对，准确扩增兔FSHR基因第10外显子上650 bp 的一段序列，共发现2 个SNP 位点，其中g.163537 G＞A 为同义突变，存在基因型GG，GA，AA；g.163619 A＞G 为错义突变，有基因型AA，AG 和GG，突变位点见图2。

图1 PCR扩增产物电泳图Fig.1 Agarose gel（1.5%）image of PCR product of FSHR gene

3.2 FSHR基因遗传多样性分析

通过计算得到家兔g.163537 G＞A 和g.163619 A＞G 位点的基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg 平衡的卡方值、群体平均杂合度以及多态信息含量，结果见表1。在天府黑兔群体中，g.163537 G＞A 位点的GG 基因型占76%，且G 等位基因频率明显高于A 等位基因，群体多态信息含量显示处于低度多态（PIC＜0.25），χ2检验表明群体处于Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）；另一方面，g.163619 A＞G 位点的AA 基因型个体数占到总数的74%，A 等位基因频率明显高于G 等位基因，多态信息含量表明群体在该位点处于低度多态（PIC＜0.25），群体处于Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

图2 FSHR基因g.163537 G＞A位点GG、GA、AA基因型（A）和g.163619 A＞G位点AA、AG、GG基因型（B）测序图Fig.2 chromatograms of DNA sequence analysis of GG，GA，AA genotypes for g.163537 G＞A polymorphism and AA，

表1 FSHR基因基因型、基因频率和遗传多样性Tab.1 Genotype and allelic frequencies，χ2 value test and diversity parameter for the FSHR gene in Tian Fu Black rabbits

3.3 FSHR不同SNP位点的基因型对体质量的影响

利用SAS 9.21 统计软件，分析g.163537 G＞A 和g.163619 A＞G 这2 个位点上不同基因型个体间42、49、56 及70 日龄体质量的差异，结果见表2。g.163537G＞A 位点对天府黑兔各日龄体质量影响不显著，但GG 基因型个体49、56 及70 日龄体质量高于GA 和AA 基因型个体，表明GG 基因型个体增重速度较快；g.163619 A＞G 位点的AA 基因型个体的42、49 日龄体质量显著高于AG 基因型个体（P＜0.05），但GG 基因型与AA 或AG 基因型个体均差异不显著，可能是由于GG 基因型样本数少，个体体质量差异较大。

表2 g.163537G＞A和g.163619A＞G位点对天府黑兔体质量的影响Tab.2 The effects of g.163537G＞A and g.163619A＞G loci on the body weight of Tian’fu black rabbits

4 讨论

FSHR 是FSH 激素的特异性受体，介导FSH 信号参与调控机体内多种生理活动[6,16-17]。然而，有关FSH 激素对脂肪沉积产生了何种影响存在争议。Amjad 等[18]研究表明FSH 激素水平负向调控了不育男性的体质量及脂肪沉积。Zaidi等[19]研究也表明FSH 信号促进了骨发生，但抑制了脂肪的生成，靶向FSH信号通路能够作为治疗肥胖的新思路。然而，有研究表明中年及60岁以上女性的FSH 激素水平与其脂肪、骨骼肌含量具有协同的上升趋势[20]。总的来讲，FSH-FSHR信号与脂肪沉积以及体质量存在关联，但有关FSHR基因对家兔体质量性状的影响还未见报道。

目前，有关FSHR基因多态性与牛[21]、羊[22]、猪[23]等动物繁殖性状存在相关的研究已经有所报道。除此以外，Fu 等[24]在人FSHR基因上发现了2 个多态位点，其中Ser680Asn 位点上不同基因型间BMI 指数、LH和FSH等水平差异显著。在王亚男[14]的研究中，京海黄鸡FSHR基因第1外显子上C159T突变形成的基因型个体间在京海黄鸡2周龄和6周龄体质量存在显著差异，第10外显子上C75429T基因型个体间2周龄体质量差异显著。兔FSHR基因包含9 个内含子和10 个外显子，其中第10 外显子负责编码跨膜结构域和胞内域[25]。姜怀志[22]在辽宁绒山羊和萨能奶山羊的FSHR基因第10外显子第1606位发现C→T的突变，可作为双羔性状的标记维位点。在谭广梅等[26]的研究中，海门山羊FSHR基因第10外显子的第90位碱基发生突变C→T，野生型等位基因与海门山羊产羔数呈显著相关。有关FSHR基因多态性在牛、羊等动物上研究较多，但在兔上的研究还未见报道。本研究在兔FSHR基因第10外显子上检测到的g.163537G＞A和g.163619A＞G位点为新发现的SNP位点。其中g.163537G＞A为同义突变，g.163619A＞G为错义突变，编码氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸。从基因型频率来看，g.163537G＞A 位点的GG 基因型在天府黑兔中占到76%，g.163619A＞G 位点的AA 基因型占到74%。多态信息含量显示2个位点均处于低度多态（PIC＜0.25），说明这2个位点的遗传变异不大。另一方面，尽管未观测到g.163537G＞A 位点对兔体质量性状有显著影响，但GG 基因型在49、56 以及70 日龄的体质量高于GA 和AA 基因型个体，表明GG 基因型个体增重速度较快；g.163619A＞G 位点对兔早期体质量影响显著，AA 基因型个体42、49日龄体质量显著高于AG 基因型个体；不同基因型个体间在56 及70 日龄的体质量差异不显著，与王亚男[14]的研究结果类似，推测FSHR第10外显子多态性可能影响兔早期生长速度。

本研究的结果表明，兔FHSR基因g.163619A＞G 位点显著影响兔42 和49 日龄体质量，该位点具有成为兔体质量性状标记辅助选择的遗传标记的可能性，可考虑将FSHR基因作为影响兔体质量性状的候选基因。